Bestimmung der Immunzellmigrations-Kinetik und der Beteiligung Neutrophiler Granulozyten an der aseptischen Prothesenlockerung als Voraussetzung für die Etablierung eines intravitalen 2-Photonen-Mikroskopieansatzes
Die aseptische Prothesenlockerung ist der limitierende Faktor für die Standzeit einer Prothese und das führende Problem in der modernen Endoprothetik. Laut Studien ist in 53-75 % die aseptische Lockerung ursächlich für eine Revision einer totalen Endoprothese. Durch die artikulierenden Komponenten des neuen Gelenks, aber auch an den Prothesen-Knochen-Kontaktflächen entstehen durch mechanische Belastung immunologisch aktive Abriebpartikel. Pathophysiologisch ist der Mechanismus noch nicht vollständig verstanden. Der Großteil der Forschung befasste sich mit der Rolle der Makrophagen und der Aktivierung von Osteoklasten, die zu Osteolysen führt. In der AG Gunzer wurde gezeigt, dass die Rolle der Neutrophilen Granulozyten unterrepräsentiert und eine Beteiligung wahrscheinlich ist. In der vorliegenden Arbeit wurde mit dem murinen Calvariamodell eine Rekrutierungskinetik von Immunzellen erstellt und diese mit dem Auftreten von Osteolysen korreliert. Zusätzlich wurden die immigrierenden Makrophagen mittels Antikörper-Färbung charakterisiert. In einem intravitalen Mikroskopieansatz wurden Makrophagen und Neutrophile Granulozyten im murinen Calvariamodell nach Partikelstimulation in vivo dargestellt. Durch die durchflusszytometrische Messung des calvarialen Granulationsgewebe nach Polyethylen- und Titanstimulation konnte gezeigt werden, dass die Anzahl immigrierter Neutrophiler Granulozyten bereits an Tag 2 deutlich erhöht war. Diese war etwas erhöht nach Stimulation mit Titan im Vergleich zu Polyethylen und im Verlauf bis Tag 6 in beiden Versuchsgruppen erneut rückläufig. Im Vergleich dazu ist die Anzahl von Makrophagen über die Zeit eher konstant, aber auch tendenziell in höherer Anzahl nach Titan-Stimulation. Im Rahmen der Charakterisierung der Makrophagen konnte eine erhöhte, jedoch nicht signifikante CD11b-Expression festgestellt werden. Bei Betrachtung des Knochenvolumens ergab sich, dass die Osteolysen nach Titan-Stimulation zwischen Tag 4 und 6 beginnen, wohingegen nach Polyethylen-Stimulation der osteolytische Effekt zu diesem Zeitpunkt noch nicht eingetreten ist. Daher liegt die Schlussfolgerung nahe, dass Titan eine stärkere immunologische Reaktion hervorruft und zu einem früheren Abbau des Knochens führt. Mit Etablierung des intravitalen Mikroskopieansatzes ist es nun möglich, durch ein Acrylfenster in vivo Zell-Zell- und Zell-Partikel-Interaktionen prinzipiell darzustellen. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit dienen als Grundlage für zukünftige Versuche, um besonders die Initiation aseptischen Prothesenlockerung genauer zu beschreiben. In dieser Arbeit zeigt sich in der Durchflusszytometrie und der Mikroskopie, dass Neutrophile Granulozyten besonders zu Beginn nachweisbar sind und womöglich die Kaskaden initiieren, die letztendlich in Osteolysen münden.
Aseptic prosthesis loosening is the limiting factor for the service life of a prosthesis and the leading problem in modern arthroplasty. According to studies, aseptic loosening is the cause for revision of total joint arthroplasty in 53- 75% of cases. Through the articulating components of the new joint, but also at the prosthesis-bone contact surfaces, immunologically active abrasion particles are generated by mechanical stress. Pathophysiologically, the mechanism is not yet fully understood. Most research has focused on the role of macrophages and activation of osteoclasts leading to osteolysis. Studies by AG Gunzer showed that the role of neutrophil granulocytes is probably underrepresented and that their involvement is possible. In the present study, the murine calvaria model was used to determine the recruitment kinetics of immune cells and to correlate these with the occurrence of osteolysis. In addition, the immigrating macrophages were characterized by means of antibody staining. In an intravital microscopy approach, macrophages and neutrophil granulocytes were visualized in the murine calvaria model after particle stimulation in vivo. Flow cytometric measurement of the calvarial granulation tissue after polyethylene and titanium stimulation showed that the number of immigrated neutrophil granulocytes was already significantly increased on day 2. This was even slightly higher after stimulation with titanium compared to polyethylene but decreased in the course up to day 6 in both experimental groups. In comparison, the number of macrophages was rather constant over time, but also tended to be higher after titanium stimulation. Characterization of the macrophages revealed increased, but non-significant CD11b expression. With regard to bone volume, it was found that osteolysis after titanium stimulation begins between days 4 and 6, whereas after polyethylene stimulation the osteolytic effect has not yet occurred at this time. Therefore, it is reasonable to conclude that titanium induces a stronger immunological response and leads to earlier bone resorption. With the establishment of the intravital microscopy approach, it is now possible to visualize cell-cell and cell-particle interactions in principle through an acrylic window in vivo.
The results of the present work could serve as a basis for future experiments to describe the initiation of aseptic loosening in prosthesis more precisely. In this work, both flow cytometry and microscopy show that neutrophil granulocytes are particularly detectable at the beginning and possibly initiate the cascades that ultimately lead to osteolysis.