Immunmodulation durch Checkpoint-Inhibitoren in präklinischen Modellen des Retinoblastoms
Das Retinoblastom ist der häufigste intraokuläre Tumor in der Kindheit. In fast allen Fällen liegt ursächlich eine Mutation des Retinoblastom-Gens (RB1) vor, seltener ist eine Amplifikation vom NB-derived myelocytomatosis viral-related oncogene (MYCN) ohne RB1 Mutation beim Retinoblastom beschrieben. Letztere sind jedoch häufig in den aggressiven Tumorstadien zu beobachten. Die Heilungschancen beim Retinoblastom sind mit über 95 % sehr hoch. Dennoch bringen viele Therapie-Optionen erhebliche Risiken und Nebenwirkungen mit sich, die mit gezielteren Behandlungsmöglichkeiten gesenkt werden sollen. Eine mögliche Option stellt die Immuntherapie dar, insbesondere die Blockade des Immun-Checkpoints programmed death receptor/ligand 1 (PD-1/PD-L1) mit entsprechenden Antikörpern. Bei der Behandlung von verschiedenen Krebserkrankungen gewinnt diese Art der Immuntherapie an Bedeutung immer noch dazu. In dieser Arbeit wurde eine mögliche Rolle von PD-1/PD-L1 beim Retinoblastom evaluiert, insbesondere auch ein möglicher Zusammenhang zwischen PD-L1 und dem Onkogen MYCN. Es konnte nachgewiesen werden, dass alle getesteten Retinoblastomzelllinien PD-L1 in unterschiedlichen Mengen exprimierten. Dabei wurde die Expression sowohl auf Gen-Ebene durch eine quantitative Real-Time-Polymerasenkettenreaktion als auch auf Protein-Ebene via Western Blot, Durchflusszytometrie und Immunfärbung nachgewiesen. In primären Retinoblastomen waren nur zwei von sieben Tumoren schwach PD-L1 positiv. Beim Vergleich von MYCN-amplifizierten und nicht MYCN-amplifizierten Retinoblastomzelllinien konnte kein Zusammenhang zwischen PD-L1 und MYCN nachgewiesen werden. Des Weiteren konnte in Neuroblastomzelllinien mit induzierbarer MYCN Expression ebenfalls keinen Zusammenhang zwischen PD-L1 und MYCN gefunden werden. Um PD-1/PD-L1 genauer zu untersuchen, wurden Ko-Kultivierungsversuche von Retinoblastomzellen und cluster of differentiation 4 (CD4) positiven T-Zellen in An- oder Abwesenheit des PD-1 Antikörpers Pembrolizumab durchgeführt. Die Interaktion von Retinoblastomzellen und T-Zellen wurde anhand von Proliferations- und Apoptoseassays untersucht. Es ließ sich dabei kein Unterschied in der Proliferations- und Apoptoserate der T-Zellen in Abhängigkeit von PD-1 Blockade feststellen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte die Bedeutung des Immun-Checkpoint PD-1/PD-L1 im Retinoblastom weiter aufgeklärt werden. Anhaltspunkte, dass es sich hierbei um ein potenzielles Therapietarget handelt, konnten allerdings nicht gefunden werden. Es sind weitere Versuche notwendig, um die Rolle von PD-1/PD-L1 im Retinoblastom, vor allem von metastasierten Fällen zu klären und mögliche alternative Targets für eine Immuntherapie vorzuschlagen.
Retinoblastoma is the most common intraocular tumor of childhood. In almost all cases, a mutation of the RB1 gene is the cause, rarer an amplification of MYCN without RB1 mutation. The chances of recovery from retinoblastoma are very high at over 95 %, but current therapies still provoke many sequelae. Immunotherapy is considered to be a possible option. In this work, the role of the immune checkpoint PD-1/PD-L1 in retinoblastoma was evaluated. Additionally a possible connection between PD-L1 and the oncogene MYCN was examined.It could be demonstrated that all tested retinoblastoma cell lines expressed PD-L1 at different levels. Expression was detected both at the gene level by quantitative real-time polymerase chain reaction and at the protein level via western blot, flow cytometry and immunostaining. In primary retinoblastomas, only two of seven tumours were weakly PD-L1 positive. When comparing MYCN-amplified and non-MYCN-amplified retinoblastoma cell lines, no correlation between PD-L1 and MYCN could be detected. Furthermore, in neuroblastoma cell lines with inducible MYCN expression, no correlation between PD-L1 and MYCN could be found either. To investigate PD-1/PD-L1 in more detail, co-cultivation experiments of retinoblastoma cells and cluster of differentiation 4 (CD4) positive T cells were performed in the presence or absence of the PD-1 antibody pembrolizumab. The interaction of retinoblastoma cells and T cells was investigated by proliferation and apoptosis assays. No difference in the proliferation and apoptosis rate of the T cells could be determined in dependence on PD-1 blockade. In the course of this work, the significance of the immune checkpoint PD-1/PD-L1 in retinoblastoma was further clarified. However, evidence that this is a potential therapeutic target could not be found. Further research is needed to clarify the role of PD-1/PD-L1 in retinoblastoma, especially metastatic cases, and to suggest possible alternative targets for immunotherapy.