Small extracellular vesicles obtained from hypoxic mesenchymal stromal cells induce ischemic stroke recovery, cerebral angiogenesis and anti-inflammation in young and aged mice
We have previously shown that small extracellular vesicles (sEVs) obtained from mesenchymal stromal cells (MSCs) improve poststroke neurological recovery and that MSC-sEVs induce ischemic neuroprotection by modulating the brain infiltration of leukocytes and specifically polymorphonuclear neutrophils (PMNs) in young mice. Since sEVs from MSCs cultured under hypoxic conditions have been demonstrated to exhibit enhanced vasculature-related protection and pro-angiogenic effects by us and others and cerebral microvascular remodeling is essential for stroke recovery, we herein evaluated the effects of sEVs from hypoxic MSCs in human cerebral microvascular endothelial cells (hCMEC/D3) in vitro assays and in young mice exposed to intraluminal middle cerebral artery occlusion (MCAO), as well as the underlying mechanisms. We further evaluated the therapeutic efficacy of MSC-sEVs in aged mice that have not been studied so far.
To study the microvascular actions of MSC-sEVs, young (8-10 weeks) male C57Bl6/j mice were exposed to intraluminal MCAO. Vehicle or sEVs (equivalent of 2×106 MSCs) obtained from cell culture media (sEVplatelet) or from MSCs cultured under ‘normoxic’ (21% O2; sEVnormoxic) or hypoxic (1% O2; sEVhypoxic) conditions were intravenously administered on days 1, 3, and 5 after ischemia. Neurological deficits, brain injury, neuronal survival, and microvascular characteristics were evaluated by Clark score, immunohistochemistry or 3D light sheet fluorescence microscopy (LSFM) over up to 56 days. In vitro, proliferation, migration, and tube formation of hCMEC/D3 were evaluated after vehicle or sEV treatment. To study the efficacy of MSC-sEVs in aged mice, young (8–10-week-old) and aged (15–24-month-old) male and female C57Bl6/j mice were exposed to intraluminal MCAO. After reperfusion or with 6 hours delay, vehicle or MSC-sEV preparations (equivalent of 2×106 MSCs) were intravenously administered. Neurological deficits, ischemic injury, blood-brain barrier (BBB) integrity, brain leukocyte infiltration, and blood leukocyte responses were evaluated over up to 7 days.
Our results show that sEVhypoxic, but not sEVplatelet or sEVnormoxic, dose-dependently promoted the proliferation, migration, and tube formation of the hCMEC/D3 cells under regular ‘normoxic’ conditions and increased the survival of hCMEC/D3 cells exposed to oxygen-glucose deprivation (OGD). Mechanistically, sEVhypoxic regulated a distinct set of angiogenesis-related miRNAs in hCMEC/D3 cells, 3 of which each were differentially upregulated (miR-126-3p, miR-140-5p, let-7c-5p) or downregulated (miR-186-5p, miR-370-3p, miR-409-3p). Proteome analysis by liquid chromatography mass-spectrometry/mass-spectrometry (LC–MS/MS) revealed 52 proteins that were differentially abundant in sEVhypoxic, 19 of which were enriched involving growth factor pathway and extracellular matrix and 33 reduced involving oxidative metabolism. In mice post-MCAO, sEVhypoxic increased microvascular length and branching point density in the previously ischemic striatum and cortex over up to 56 days, increased long-term neuronal survival, reduced brain atrophy, and enhanced neurological recovery. Notably, sEVhypoxic-induced angiogenesis in vivo depended on the presence of PMNs, since, sEVhypoxic did not promote microvascular network remodeling in PMN-depleted mice. Furthermore, aged mice exhibited greater neurological deficits, larger infarct volume and brain edema, higher BBB permeability, and more severe immune responses in both blood and brain than young mice after intraluminal MCAO. sEVhypoxic reduced neurological deficits, infarct volume, brain edema, and neuronal injury in young and aged mice of both sexes, when delivered immediately postreperfusion or with 6 hours delay. Mechanistically, flow cytometry showed that sEVhypoxic significantly decreased leukocyte and specifically PMN, monocyte, and macrophage infiltrates in ischemic brains and reduced the number of monocytes and activated T cells in peripheral blood of aged mice.
Hence, hypoxic preconditioning enhances the restorative effects of MSC-sEVs. More specifically, sEVs from hypoxic MSCs have distinct angiogenic properties that promote brain remodeling and neurological recovery and immunomodulatory effects that induce postischemic neuroprotection and anti-inflammation in young and aged mice.
Wir haben bereits gezeigt, dass kleine extrazelluläre Vesikel (sEVs), die aus mesenchymalen Stromazellen (MSCs) gewonnen werden, die Neuroregeneration nach einem Schlaganfall steigern und die neurologische Genesung verbessern, und dass MSC-sEVs bei jungen Mäusen eine ischämische Neuroprotektion induzieren, indem sie die Infiltration des Gehirns mit Leukozyten und insbesondere polymorphkernigen Neutrophilen (PMNs) modulieren. Da sEVs aus MSCs, die unter hypoxischen Bedingungen kultiviert wurden, nachweislich einen verbesserten gefäßbezogenen Schutz und pro-angiogene Effekte aufweisen und der zerebrale mikrovaskuläre Umbau für die Erholung nach einem Schlaganfall essentiell ist, untersuchten wir hier die Wirkungen von sEVs aus hypoxischen MSCs in humanen zerebralen mikrovaskulären Endothelzellen (hCMEC/D3) im In-vitro-Assay und in jungen Mäusen, die einem intraluminalen Verschluss der mittleren Hirnarterie (MCAO) ausgesetzt waren, sowie die zugrunde liegenden Mechanismen. Darüber hinaus untersuchten wir die therapeutische Wirksamkeit von MSC-sEVs bei älteren Mäusen, die bisher noch nicht untersucht wurden.
Um die mikrovaskuläre Wirkung von MSC-sEVs zu untersuchen, wurden junge (8-10 Wochen) männliche C57Bl6/j-Mäuse einem intraluminalen MCAO-Modell ausgesetzt. Vehikel oder sEVs (Äquivalent von 2×106 MSCs) aus Zellkulturmedien (sEVplatelet) oder aus MSCs, die unter normoxischen (21% O2; sEVnormoxic) und hypoxischen (1% O2; sEVhypoxic) Bedingungen gezüchtet wurden, wurden an den Tagen 1, 3 und 5 nach der Ischämie intravenös verabreicht. Neurologische Defizite, Hirnschädigung, neuronales Überleben und mikrovaskuläre Eigenschaften wurden mittels Clark-Score, Immunhistochemie oder 3D-Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie (LSFM) über bis zu 56 Tage bewertet. In vitro wurden Proliferation, Migration und Röhrenbildung von hCMEC/D3 nach Behandlung mit Vehikel oder sEV untersucht. Um die Wirksamkeit von MSC-sEVs in gealterten Mäusen zu untersuchen, wurden junge (8-10 Wochen alte) und gealterte (15-24 Monate alte) männliche und weibliche C57Bl6/j-Mäuse einem intraluminalen MCAO ausgesetzt. Nach der Reperfusion oder mit einer Verzögerung von 6 Stunden wurden Vehikel oder MSC-sEV-Präparate (Äquivalent von 2×106 MSCs) intravenös verabreicht. Die neurologischen Defizite, die ischämische Schädigung, die Integrität der Blut-Hirn-Schranke (BBB), die Leukozyteninfiltration des Gehirns und die Leukozytenreaktionen im Blut wurden über einen Zeitraum von bis zu 7 Tagen untersucht.
Die Ergebnisse zeigen, dass sEVhypoxic, aber nicht sEVplatelet oder sEVnormoxic, dosisabhängig die Proliferation, Migration und Tubusbildung der hCMEC/D3-Zellen unter normalen "normoxischen" Bedingungen förderten und das Überleben von hCMEC/D3-Zellen erhöhten, die einem Sauerstoff-Glukose-Entzug (SGE) ausgesetzt waren. Mechanistisch gesehen regulierte sEVhypoxic eine Reihe von mit der Angiogenese zusammenhängenden miRNAs in hCMEC/D3-Zellen, von denen jeweils drei in unterschiedlicher Weise hochreguliert (miR-126-3p, miR-140-5p, let-7c-5p) oder herunterreguliert (miR-186-5p, miR-370-3p, miR-409-3p) wurden. Die Proteomanalyse mittels Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie/Massenspektrometrie (LC-MS/MS) ergab 52 Proteine, die in sEVhypoxic unterschiedlich häufig vorkamen, von denen 19 in Bezug auf den Wachstumsfaktorweg und die extrazelluläre Matrix angereichert und 33 in Bezug auf den oxidativen Stoffwechsel reduziert waren. Bei Mäusen nach einem Himinfarkt erhöhten sEVhypoxic die mikrovaskuläre Länge und die Dichte der Verzweigungspunkte im zuvor ischämischen Striatum und Kortex über einen Zeitraum von bis zu 56 Tagen, erhöhten das langfristige neuronale Überleben, reduzierten die Hirnatrophie und verbesserten die neurologische Erholung. Bemerkenswert ist, dass die durch sEVhypoxic induzierte Angiogenese in vivo vom Vorhandensein von PMNs abhing, da sEVhypoxic den Umbau des mikrovaskulären Netzwerks in PMN-depletierten Mäusen nicht förderten. Darüber hinaus wiesen ältere Mäuse nach intraluminalem MCAO größere neurologische Defizite, ein größeres Infarktvolumen und Hirnödem, eine höhere Durchlässigkeit der BBB und schwerere Immunreaktionen sowohl im Blut als auch im Gehirn auf als junge Mäuse. sEVhypoxic reduzierten neurologische Defizite, Infarktvolumen, Hirnödem und neuronale Verletzungen bei jungen und älteren Mäusen beider Geschlechter, wenn sie unmittelbar nach der Reperfusion oder mit 6 Stunden Verzögerung verabreicht wurde. Mechanistisch gesehen zeigte die Durchflusszytometrie, dass sEVhypoxic die Leukozyten- und insbesondere die PMN-, Monozyten- und Makrophageninfiltrate in ischämischen Gehirnen signifikant verringerten und die Anzahl der Monozyten und aktivierten T-Zellen im peripheren Blut von gealterten Mäusen reduzierten.
Geschlussfolgerf wird, dass hypoxische Präkonditionierung die restaurativen Wirkungen von MSC-sEVs verstärkt. sEVs aus hypoxischen MSCs haben ausgeprägte angiogene Eigenschaften, die den Umbau des Gehirns und die neurologische Genesung fördern und bei jungen und alten Mäusen eine postischämische Neuroprotektion und Entzündungshemmung bewirken.
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