Der Einfluss einer korrekten CAV1-Funktionalität und -Lokalisation auf die zelluläre Strahlenantwort beim Prostatakarzinom

Die Resistenz solider Tumore gegenüber einer Chemo- und Strahlentherapie (Radiotherapie, RT) bleibt ein Haupthindernis bei der Krebsbehandlung. Darüber hinaus gewinnt dabei das Tumorstroma zunehmend an Bedeutung. Obwohl das Stroma unter physiologischen Bedingungen eine wichtige Barriere für die maligne Transformation der Zellen darstellt, ändern sich dessen funktionelle Eigenschaften während der neoplastischen Transformation, sodass hinsichtlich der Invasivität und Progression bei Krebserkrankungen eine Schlüsselrolle eingenommen wird. Es wird die Strahlenantwort beeinflusst und demnach zur Therapieresistenz beigetragen, was mit einem schlechteren klinischen Ergebnis einhergeht. Insbesondere beim Prostatakarzinom (PCa) konnte für das Membranprotein Caveolin 1 (CAV1) gezeigt werden, dass es im Zuge der Tumorprogression zu einer charakteristischen stromal-epithelialen Umverteilung von CAV1 kommt. Neben einer Zunahme der CAV1-Expression in malignen Prostata-Epithelzellen korrelierte ein Verlust der CAV1-Expressionen im Tumorstroma, mit erhöhter Progression, Invasion, Metastasierung und Therapieresistenz insbesondere gegenüber einer RT.

Daher wurde in der vorliegenden Arbeit eruiert, wie sich eine Zunahme des epithelialen CAV1-Gehalts einerseits und der Verlust von stromalem CAV1 andererseits auf die zellulären Eigenschaften und insbesondere auf die Strahlenantwort von Prostatakarzinomzellen und stromalen Fibroblasten auswirkt. Dementsprechend sollte in der vorliegenden Arbeit untersucht werden, welchem dieser Befunde hier eine Schlüsselkomponente zur Resistenzentwicklung zukommt. Dafür erfolgten unterschiedliche in vitro Kurzzeit- und Langzeitversuche sowie dreidimensionale (Co)-Kultivierungen.

In Bezug auf den möglichen Einfluss der Zunahme des epithelialen CAV1-Gehalts wurde die Strahlenantwort von LNCaP-Prostatakarzinomzellen nach der Überexpression von Wildtyp CAV1 (CAV1 WT), sowie den CAV1 Mutanten CAV1-Y14F (Phosphorylierungs-defizient) und CAV1-P132L (nicht-Plasmamembran-lokalisiert) untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die CAV1-Überexpression einen epithelial-mesenchymalen Transition (EMT)-Phänotyp in den jeweiligen LNCaP Zellen forcierte. Eine Überexpression von CAV1 WT bedingt weiterhin das Wachstum von in einer Matrix eingebetteten LNCaP Sphäroiden und ging mit einer verminderten Sensitivität gegenüber einer RT einher. Dabei konnte herausgestellt werden, dass neben der Funktionalität auch die Lokalisierung von CAV1 an der Plasmamembran notwendig ist. Ein invasiveres Wachstum und die gesteigerte RT-Resistenz konnten nicht festgestellt werden, wenn Phosphorylierungs-defizientes CAV1 überexprimiert wurde oder CAV1 nicht an der Plasmamembran lokalisiert ist. In Bezug auf mögliche zugrunde liegende Mechanismen konnte gezeigt werden, dass das vermehrte PCa-Zellwachstum infolge der Überexpression von CAV1 WT auf einem durch die Serin-Threonin-Kinase AMP-aktivierte Proteinkinase (AMPK) vermittelten Stoffwechselmechanismus beruht. Dieser wiederum kann zusammen mit einer Erhöhung der Glukose- und Fettsäureoxidation zu erhöhten Glykolyseraten führen. Hier zeigte sich, dass eine induzierte Expression des Wildtyp- oder des mutierten CAV1 nur geringe Auswirkungen auf die mitochondrialen Atmungsraten der LNCaP-Zellen besitzt, aber die jeweiligen Glykolyseraten erhöht wurden, was auf einen höheren Energiebedarf hinweist. Insbesondere bei CAV1-P132L LNCaP-Zellen wurde ein höherer Energiebedarf festgestellt. Gleichzeitig konnte in den CAV1-P132L LNCaP-Zellen eine Abnahme des zellulären Cholesterolgehalts aufgezeigt werden, obwohl im Allgemeinen überexprimierte CAV1-Mengen mit gesteigerten Cholesterolmengen einhergehen und nur eine reduzierte Cholesterol-Biosynthese im Zusammenhang mit einer besseren Tumorkontrolle steht. Hinsichtlich des geringeren Cholesterolgehalts zeigten sich erwartungsgemäß in den CAV1-P132L LNCaP-Zellen signifikant weniger Plasmamembran-Signalplattformen. Dies steht im Einklang mit den metabolischen Veränderungen, wie der Erhöhung der Glykolyse zur Deckung des jeweiligen Energiebedarfs. Die Ursache dafür ist vermutlich eine reduzierte (metabolische) Lipid- und Cholesterolverwertung innerhalb der CAV-P132L LNCaP-Zellen.

Der invasivere EMT-Phänotyp sowie die gesteigerte RT-Resistenz von CAV1 WT exprimierenden LNCaP-Zellen konnte erfolgreich durch eine kombinierte Behandlung mit den SRC-Inhibitoren Dasatinib und Bosutinib begrenzt werden, was schließlich zu einer Radiosensibilisierung führte. Neben der verminderten Ausbildung des EMT-Phänotyps zeigte sich mechanistisch Tumor-suppressive Eigenschaften durch eine Reduktion der HSP27 und AMPK-Expression und tendenzielle Reduktionen hoher CAV1-Expressionen.

Demnach erwies sich das Targeting von epithelialem CAV1, insbesondere die Hemmung der Zunahme des CAV1-Spiegels beim fortgeschrittenem PCa, als die möglicherweise bessere therapeutische Strategie, um die Krebszellen zu eliminieren.

Darüber hinaus sollte eine SRC-Inhibition im stromalen Kompartiment die Strahlenantwort von PCa Zellen unterstützen können, da eine SRC-abhängige Modulation von CAV1 in stromalen Zellen, genauer gesagt die Stabilisierung der CAV1-Level in stromalen Fibroblasten, vermutlich eine Radiosensibilisierung bewirkt. Allerdings konnte in Folge der SRC-Inhibition keine Wachstumsreduktion co-kultivierter PCa LNCaP Zellen mit stromalen HS5 Zellen mit starker CAV1-Expressio festgestellt werden. Zudem konnten auch weitere Inhibitoren keine strahlensensitivierenden Effekte der co-kultivierten PCa und Fibroblastenzellen aufzeigen. Erstaunlicherweise konnte jedoch mittels 3D Co-Kulturen der PCa LNCaP oder 22RV1 Zellen mit stromalen Fibroblasten festgestellt werden, dass die co-kultivierten Fibroblasten hier der Strahlenantwort entgegenwirkten. In stromalen HS5 zeigte sich zudem, dass eine strahleninduzierte Veränderung zum reaktiveren Fibroblasten-Phänotyps erfolgt und dies mit einem erhöhten metabolischen Potenzial einherging, was nicht durch eine kombinierte Behandlung mit Dasatinib beeinflusst wird.

Aktivierte Fibroblasten, die niedrige CAV1-Spiegeln aufweisen, dienen zur Versorgung benachbarter Krebszellen, weshalb der Einfluss von CAV1 in den WPMY-1 Fibroblasten mit geringen endogenen CAV1-Spiegeln untersucht werden sollte. In Folge der Re-Expression von Wildtyp CAV (CAV1 WT) und mutiertem CAV1-Y14F (Phosphorylierungs-defizient) oder CAV1-DD (Degradations-defizient) wurde das Migrationspotenzial im Vergleich zu kontrolltransduzierten WPMY-1 Zellen zwar reduziert, aber es konnte nur eine tendenzielle Radiosensitivierung festgestellt werden. Ebenso konnten keine signifikanten strahleninduzierten Wachstumsreduktionen gebildeter Sphäroide aufgezeigt werden. Dementsprechend waren auch in der Co-Kultur mit den gering CAV1 exprimierenden LNCaP PCa-Zellen keine verbesserten Strahlenantworten in Folge der Re-Expression von CAV1 in stromalen Zellen ersichtlich. Dies ist vermutlich auf die verwendeten WPMY-1 Zellen selbst zurückzuführen, da diese zwar aus der peripheren Zone einer histologisch normalen Prostata eines gesunden Spenders stammten, aber als Myofibroblast per se einen reaktiveren Phänotyp im Vergleich zu normalen Fibroblasten zeigen. Für die Überexpression der eingebrachten CAV1-Varianten war eine Ursprungszelllinie mit geringem endogenem CAV1-Gehalt jedoch notwendig und nur die WPMY-1 Zellen erfüllten dieses Kriterium als Prostata-Fibroblasten.

Metabolisch zeigte sich allerdings, dass Fibroblasten im Vergleich zu PCa-Zellen ein erhöhtes metabolisches Potenzial aufweisen, wobei in Fibroblasten mit niedrigen CAV1-Spiegeln (WPMY1-) dieses zusätzlich noch erhöht ist. Darüber hinaus ist bereits bekannt, dass CAV1-exprimierende PCa-Zellen ein erhöhtes metabolisches Potenzial besitzen. Im fortgeschrittenen PCa-Stadium, das durch niedrige CAV1-Mengen im stromalen Kompartiment und hohe CAV1-Mengen in den malignen Epithelzellen gekennzeichnet ist, stellt demnach das Targeting von stromalen Fibroblasten ein vielversprechendes Ziel für CAV1-veränderte therapeutische Strategien dar. Eine Stabilisierung des stromalem CAV1 könnte dabei das erhöhte metabolische Potenzial von Prostata-Fibroblasten mit niedrigen endogenen CAV1-Spiegeln begrenzen.

Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass dem Verlust von stromalem CAV1 eine entscheidendere Bedeutung als der Re-Expression von epithelialem CAV1 beim PCa für die Resistenzentwicklung bei der Radiotherapie zukommt. Das gezielte Targeting / Ansprechen von krebsassoziierten Fibroblasten stellt somit durch eine Limitierung der Fibroblastenaktivierung, möglicherweise durch Begrenzung des Verlusts von stromalem CAV1, eine geeignete Strategie dar, um die resistenzfördernden Signale des Tumorstromas zu hemmen.

Resistance of solid tumors to chemo- or radiotherapy (RT) remains the predominant limitations of curative cancer treatments, going along with differences within the tumor microenvironment. This is of crucial importance due to its potential to function as a negative and positive regulator in cancer progression and invasion. Increasing evidence indicates a characteristic stromal-epithelial redistribution of the membrane protein caveolin 1 (CAV1) during tumor progression in prostate cancer (PCa). Thereby, CAV1 expression was shown to be increased in stromal fibroblasts in malignant prostate epithelial cells, while loss of CAV1 occurs within the tumor stroma and correlates with an increased progression, invasion, metastatic potential, and therapy resistance, especially after RT.

The main goal of this thesis was to understand how the gain of epithelial CAV1 and / or loss of stromal CAV1 effects cellular responses and radiation response in PCa cells as well as stromal fibroblasts focusing on the evaluation of their implication for radioresistance.

Therefore, stable transfected LNCaP PCa cells, overexpressing different CAV1 mutants (phosphorylation-deficient CAV1-Y14F and localization-changed CAV-P132L) or wildtyp CAV (CAV1 WT) were analyzed regarding the radiation response. CAV1 overexpression was shown to cause an epithelial-mesenchymal transition (EMT) in LNCaP cells. However, only CAV1 WT was able to increase the invasive growth of LNCaP spheroids to attenuate sensitivity against RT. Function and localization of CAV1 at the plasma membrane seem to be critical variables because invasive growth and increased RT-resistance are not shown in the context of phosphorylation-deficient or not plasma membrane localized CAV1. Further it has been shown that increased PCa cell growth in CAV1 WT expressing cells is based on a metabolic mechanism mediated by serine-threonine kinase AMPK-activated protein kinase (AMPK). This resulted in increased glycolysis rate paralleled by an increase in glucose and fatty acid oxidation. Here respiration rate only slightly affects mitochondrial expression of wildtype or mutated CAV1 while glycolysis was increased leading to a higher energy demand. CAV1-P132L cells are shown to require a higher amount of energy while cholesterol utilization was reduced in these cells. In general, high amounts of CAV1 come along with increased cholesterol levels and only reduced cholesterol biosynthesis is associated with better tumor control. A reduction of cellular cholesterol and less plasma membrane platforms were found in CAV1-P132L expressing cells, which is consistent with metabolic changes, such as increasing glycolysis for the respective energy demands. This is probably caused by reduced (metabolic) lipid and cholesterol utilization within the CAV-P132L LNCaP cells. 

Combined treatment with the SRC-inhibitors dasatinib and bosutinib was sufficient to limit the more invasive EMT phenotype and increased RT resistance of CAV1 WT expressing LNCaP cells. The SRC inhibitors radiosensitize the CAV1 WT expressing LNCaP cells by alleviating the EMT phenotype and, on a mechanistic level, reduce the tumor promoting factors HSP27 and AMPK expression. Moreover, high CAV1 expression tend to decrease after inhibitor treatment.

Accordingly, targeting epithelial CAV1, specifically inhibiting the increase of CAV1 level in advanced PCa, proved to be a promising therapeutic strategy to eliminate cancer cells.

Moreover, SRC inhibition in the stromal compartment was suggested to promote the radiation response of PCa cells by stabilization of CAV1 levels in stromal fibroblasts which induce radiosensitization. However, co-culture of PCa LNCaP cells with stromal HS5 cells with strong CAV1 expression revealed no change in cell proliferation or growth after SRC inhibition. Other inhibitors also failed to initiate any radiosensitizing effects on the co-cultured PCa and fibroblast cells. Using 3D co-cultures of PCa LNCaP or 22RV1 cells with stromal fibroblasts, co-cultured fibroblasts were shown to counteract the radiation response. In stromal HS5, radiation induced changes into the more reactive fibroblast phenotype associated with an increased metabolic potential, which is not affected by combined treatment with dasatinib.

However, activated fibroblasts associated with low CAV1 levels provide adjacent cancer cells with tumor-promoting molecules. Therefore, the impact of CAV1 in WPMY-1 fibroblasts with low endogenous CAV1 levels is of current interest. As a result of re-expression of wild-type CAV (CAV1 WT) and mutant CAV1-Y14F (phosphorylation-deficient) or CAV1-DD (degradation-deficient), the migration potential was reduced compared to control-transduced WPMY-1 cells but radiosensitization was just barely detectable. Similarly, no significant radiation-induced growth reductions of formed spheroids could be demonstrated. In co-culture with the low CAV1 expressing LNCaP cells re-expression of CAV1 in stromal cells was insufficient to improve radiation responses, probably due to the phenotype of used WPMY-1 cells. As myofibroblasts, these cells show a more reactive phenotype compared to normal fibroblasts even though they were isolated from the peripheral zone of a histologically normal prostate from a healthy donor. However, a cell line with a low endogenous CAV1 level was required for overexpression of the introduced CAV1 variants, and only the WPMY-1 cells fulfilled this criterion as prostate fibroblasts.

Metabolically, fibroblasts were shown to have an increased metabolic potential compared to PCa cells, being additionally increased in fibroblasts with low CAV1 levels (WPMY1-). CAV1-expressing PCa cells are already known to have an increased metabolic potential. Stromal fibroblasts are a promising target to approach CAV1-modified therapeutic strategies in the advanced PCa stage, which is characterized by low levels of CAV1 in the stromal compartment and high levels of CAV1 in the malignant epithelial cells. The stabilization of stromal CAV1 might limit the increased metabolic potential of prostate fibroblasts with low endogenous CAV1 levels.

In conclusion, loss of stromal CAV1 rather than re-expression of epithelial CAV1 in PCa is relevant to enhancement in radioresistance to radiotherapy. Thus, by limiting fibroblast activation, possibly by limiting the loss of stromal CAV1, the specific targeting/response of cancer-associated fibroblasts represents an appropriate strategy to inhibit tumor stromal resistance-promoting interactions.

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