Medical application and biological occurrence of inorganic nanoparticles and nanostructures
Die Doktorarbeit unter dem Titel “Medical application and biological occurrence of inorganic nanoparticles and nanostructures“ präsentiert Ergebnisse von drei interdisziplinären Forschungsprojekten. Diese fokussieren sich auf die Synthese und Anwendung anorganischer Nanoträger in Studien an lebenden Zellen sowie auf die Anwendung anorganischer chemischer Methoden bei der Untersuchung biologischer Nanostrukturen.
Im ersten Projekt wurden Calciumphosphat-Nanopartikel als Träger verwendet, um therapeutische siRNA (gegen NF-ĸB p65) in eukaryotische Zellen zu transportieren. In vitro Studien an Mauszelllinien zeigten, dass die Nanopartikel nicht zytotoxisch waren und von den Zellen aufgenommen wurden. Darüber hinaus hemmte die von Nanopartikeln gelieferte siRNA effizient die Expression von NF-ĸB p65 in entzündeten Zellen. Die Herunterregulation von NF-ĸB war das Hauptziel des Projekts, da Auffälligkeiten in der NF-ĸB Regulation, insbesondere die Überexpression, von erheblicher Bedeutung für die Pathogenese und den Verlauf entzündlicher Erkrankungen sind. Die Dekoration der Nanopartikel mit Liganden und die Stabilisierung mit einem Nahinfrarot-markierten Polymer erweiterten das Anwendungspotenzial von Nanopartikeln für die Zell-Targeting Studien bzw. in vivo Experimente an Mäusen. Darüber hinaus wurden im Projekt eingehende Auflösungsstudien zum Verhalten von Nanopartikeln unter sauren Bedingungen durchgeführt, um den lysosomalen Abbau der Nanopartikel nachzuahmen. Somit sind die in dieser Dissertation vorgestellten Nanopartikel vielversprechende Kandidaten für zukünftige Anwendungen in der experimentellen Gentherapie im Zusammenhang mit der Regulation der NF-ĸB Expression in Zellen.
Das zweite Projekt beschreibt umfassende Studien zur chemischen Zusammensetzung und Mikrostruktur von versteinertem Rüsseltierzahnschmelz. Die in diesem Projekt untersuchten Proben stammten aus Ägypten und Indien und waren bis zu 34 Millionen Jahre alt. Analytische Methoden der anorganischen Chemie, (wie z.B. Elementaranalyse, PXRD, IR-Spektroskopie usw.), waren hilfreich bei der Durchführung detaillierter Studien zur elementaren Zusammensetzung von fossilem Schmelz. Mineralisierter Zahnschmelz erwies sich als sehr beständig gegen chemische Veränderungen (während der Fossilisation) und zeigte unabhängig vom Probenalter eine ähnliche Zusammensetzung. Diagenetische Veränderungen im Schmelz waren jedoch nur in geringem Umfang vorhanden. Mikroskopische Studien bestätigten ein hohes Maß an Erhaltung der prismatischen Mikrostruktur des Zahnschmelzes und bestätigten das Vorhandensein evolutionärer Anpassungen des Rüsseltierschmelzes als Antwort auf Veränderungen des Paläoklimas und der Paläoumgebung. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass Schmelz, neben anderen mineralisierten tierischen Hartgeweben, aufgrund seiner hohen Beständigkeit gegen chemische Veränderungen externer Herkunft ein besonders attraktives Material für chemische und paläontologische Studien ist. In dieser Dissertation wurden auch neue Daten zur Zusammensetzung und Mikrostruktur des Zahnschmelzes ausgestorbener indischer Rüsseltiere vorgestellt.
Im dritten und letzten Projekt wurden die Wechselwirkungen zwischen ultrakleinen Goldnanopartikeln und Bakterien (Escherichia coli) mit fortschrittlichen Methoden der Fluoreszenzmikroskopie untersucht. In diesen Studien wurden Nanopartikel in Clustergröße verwendet, um die Aufnahme von Nanopartikeln durch Bakterien zu verbessern. Die Gold-Nanoträger wurden mit verschiedenen photostabilen Fluorophoren kovalent gekoppelt und in Studien mit Bakterien eingesetzt. Ultrakleine markierte Nanopartikel wurden schnell von Bakterien internalisiert. Die Aufnahme der Partikel war für die Zellen nicht tödlich und die Aufnahmeeffizienz war dosisabhängig. Weiterhin konnte in den Studien der Vorteil der Anwendung von Nanopartikel-gekoppelten Farbstoffen gegenüber freien Farbstoffen gezeigt werden. Für eine noch verbesserte Bildgebung wurden in diesem Projekt zusätzlich genetisch modifizierte autofluoreszierende Bakterien verwendet. Ultrakleine Goldnanopartikel zeigten gute Zellpenetrationseigenschaften und zeichneten sich durch ein breites Spektrum möglicher chemischer Modifikationen aus. Daher können sie, nach stabiler Kopplung mit Antibiotika, auch als Alternative zu herkömmlichen Therapien bei der Behandlung von bakteriellen Infektionen eingesetzt werden.
Interdisciplinary research projects presented in this doctoral thesis concern broadly-defined application of inorganic nanoparticles in studies on the interactions with living cells (eukaryotic and prokaryotic), as well as show how inorganic chemistry, and its analytical methods, can be used in investigations of biological nanostructures.
In the first project, calcium phosphate nanoparticles, as inorganic nanoplatforms, were used for the delivery of therapeutic siRNA into eukaryotic cells. The siRNA was destined to silence the expression of the p65 subunit of NF-κB. The latter is an important transcription factor involved in cell inflammatory and immune response. The nanoparticles showed good physicochemical properties, were efficiently loaded with therapeutic siRNA and fulfilled quality criteria to be further applied in biological experiments. In vitro studies carried out in different types of murine blood compartment cells demonstrated that the nanoparticles were not cytotoxic and were readily internalized by cells. Nanoparticle-delivered siRNA effectively inhibited the expression of NF-κB p65 in the inflamed cells. The downregulation effect could be observed on the cellular level of p65 mRNA and p65 protein expression. Interestingly, a downregulation effect on the expression of key cytokines (TNF-α, IL-6, INF-β) induced by unloaded calcium phosphate nanocarriers could be also demonstrated. This observation opened a new perspective in the understanding of complex cell-nanoparticle interactions. The importance of superficial functionalization of calcium phosphate nanoparticles with silica shell was confirmed in the dissolution studies, whereas co-localization experiments enabled in-depth investigations of intracellular processing of the nanoparticles and their biomolecule cargo. Silica functionalization of calcium phosphate nanoparticles enabled also decoration of the nanoparticles with ligands, to improve nanoparticle uptake by the target cells. Stabilization of the nanoparticles with a near-infrared-labelled polymer extended the application range of siRNA-loaded calcium phosphate nanoparticles also to in vivo research in mice, indicating the therapeutic potential of biocompatible and biomolecule-loaded inorganic nanocarriers in experimental gene therapy, based on regulation of the NF-κB expression on a molecular level.
The second project, described in this thesis, concerned extensive compositional and microstructural studies on tooth enamel of proboscideans, with a particular focus on the enamel of extinct elephant taxa. Studied fossils (tooth fragments) were found in Egypt and India, and had the age up to 34 millions of years (the samples covered the time range of Tertiary and Quaternary). Compositional analyses confirmed that highly-mineralized enamel was only little sensitive to chemical alteration and demonstrated a similar elemental composition over the time. Substitution-related changes in the enamel bioapatite were identified, however, they were mostly not related with the sample age. Diagenetic alteration of the enamel, although detected, was not significant. Microscopic investigations revealed that the enamel microstructure was well-preserved. The spectrum of investigated samples allowed to observe the process of proboscidean enamel evolution, with regard to development and differentiation of its prismatic microstructure, and evolution of prism cross-section patterns. Tooth adaptations in proboscideans were driven by changes of the paleoclimate, which forced animals to migrate, occupy new habitats and modify their diet, depending on conditions prevailing in the paleoecosystems. Results of the project indicate that the enamel, with its extraordinary resistance to chemical alteration of external origin, is an attractive material, among other available mineralized animal hard tissues, for paleontological studies and provides a wealth of information which are helpful in understanding animal evolution and adaptation mechanisms, and reconstructing the paleoclimate and paleoenvironments.
In the third and last project presented in this thesis, the interactions between inorganic nanoparticles and bacterial cells (Escherichia coli strains) were studied. For this purpose, ultrasmall gold nanoparticles were applied. Great possibilities of chemical modification of the nanoparticle surface were utilized to covalently decorate the nanoparticles with photostable fluorophores. The project assumed application of cluster-sized gold nanoparticles to enhance, due to the ultrasmall size, the uptake of nanoparticles by autofluorescent bacteria. For high quality 3D imaging of the samples, advanced fluorescence microscopy techniques were used, such as confocal laser scanning microscopy and super resolution microscopy. Successful internalization of the nanoparticles by bacterial cells could be demonstrated in all studied experimental setups. Incubation with the nanoparticles did not adversely affect the viability of bacterial cultures, including nanoparticle-positive cells, indicating non-cytotoxicity of the ultrasmall gold nanoparticles. The efficiency of nanoparticle uptake by bacteria depended on particle concentration in the environment. The advantage of the application of nanoparticlecoupled fluorophores over free dyes, in this kind of microbiological studies, was also demonstrated. The ultrasmall gold nanoparticles have proved the ability to penetrate the bacterial cell envelope, without causing lethal effects to cells, and demonstrated high chemical modification possibilities, which makes them potential candidates for application in the treatment of bacterial infections, e.g., after coupling with appropriate antimicrobials. Results presented in this thesis indicate that fluorescent ultrasmall gold nanoparticles contribute to a better understanding of the nature of interactions between nanoparticles and prokaryotic cells, which is less studied than in eukaryotic cells, in particular with regard to non-lethal uptake.
Interdyscyplinarne projekty badawcze przedstawione w tej pracy doktorskiej dotyczą szeroko pojętego zastosowania nieorganicznych nanocząstek w badaniach ich oddziaływania z komórkami żywymi, zarówno eukariotycznymi, jak i prokariotycznymi, jak również pokazują w jaki sposób chemia nieorganiczna i jej metody analityczne są pomocne w badaniach biologicznych nanostruktur.
Pierwszy z projektów zakładał zastosowanie nieorganicznych nanoplatform w dostarczaniu terapeutycznych biomolekuł do komórek eukariotycznych. W tym celu, nanocząstki forsforanu wapnia użyto jako nośników dla siRNA, specyficznego do wyciszania ekspresji podjednostki p65 NF-κB. Ten ostatni to ważny czynnik transkrypcyjny, uczestniczący w zapalnej i immunologicznej odpowiedzi komórki. Zastosowane w projekcie nanocząstki charakteryzowały się odpowiednimi właściwościami fizykochemicznymi, były wydajnie sprzężone z terapeutycznym siRNA i spełniały wymagania jakościowe dla zastosowania w badaniach biologicznych. Przeprowadzone z wykorzystaniem różnych rodzajów mysich komórek krwi eksperymenty in vitro wykazały, że nanocząstki fosforanu wapnia nie były cytotoksyczne i były wychwytywane przez komórki, natomiast dostarczone za ich pośrednictwem siRNA wydajnie hamowało ekspresję NF-κB p65 w komórkach znajdujących się w stanie zapalnym. Efekt ten można było zaobserwować zarówno na poziomie komórkowej ekspresji mRNA p65, jak i białka p65. Co ciekawe, zjawisko wyciszania ekspresji udało się wykazać również dla kluczowych cytokin (TNF-α, IL-6, INF-β) przy zastosowaniu niesprzężonych z biomolekułami nanonośników fosforanu wapnia. Obserwacja ta pozwala na lepsze zrozumienie złożonych oddziaływań pomiędzy nanocząstkami, a komórkami. Istotną rolę opłaszczania nanocząstek fosforanu wapnia przy użyciu krzemionki wykazano w badaniach rozpuszczalności, a eksperymenty kolokalizacji pozwoliły na przeprowadzenie pogłębionych badań nad wewnątrzkomórkowym przetwarzaniem nanocząstek i sprzężonych z nimi biomolekuł. Funkcjonalizacja nanocząstek płaszczem krzemionkowym umożliwiła ponadto dekorację powerzchni nanocząstek ligandami, w celu poprawienia wydajności wychwytu nanocząstek przez komórki docelowe. Stabilizacja nanocząstek polimerem znakowanym barwnikiem bliskiej podczerwieni rozszerzyła zakres aplikacyjny nanonośników fosforanu wapnia, sprzężonych z siRNA, na badania in vivo w organizmach myszy, potwierdzając tym samym potencjał terapeutyczny biokompatybilnych i niosących biomolekuły nieorganicznych nanocząstek w eksperymentalnej terapii genowej opartej na regulacji ekspresji NF-κB na poziome molekularnym.
Drugi z projektów, opisany w niniejszej pracy, dotyczył obszernych badań składu chemicznego i mikrostruktury szkliwa zębów trąbowców, ze szczególnym uwzględnieniem szkliwa pochodzącego od wymarłych gatunków słoni. Badane skamieliny (fragmenty zębów) pochodziły z Egiptu i Indii, i charakteryzowały się wiekiem do 34 milionów lat (pokrywały więc czas Trzeciorzędu i Czwartorzędu). Analizy składu potwierdziły, że wysoce zmineralizowane szkliwo było jedynie w niewielkim stopniu wrażliwe na modyfikacje chemiczne i wykazywało porównywalny skład, niezależnie od wieku próby. Zmiany o charakterze substytucji w bioapatycie szkliwa zostały wykazane, jednakże w większości przypadków nie były one zależne od upływu czasu. Modyfikacje pochodzenia diagenetycznego były obecne w skamieniałym szkliwie, natomiast nie były one znaczące. Analizy mikroskopowe wykazały, że mikrostruktura szkliwa była bardzo dobrze zachowana. Spektrum dobranych prób pozwoliło zaobserwować proces ewolucji szkliwa trąbowców, zarówno w kontekście rozwoju i różnicowania jego pryzmatycznej mikrostruktury, jak i ewolucji wzoru przekroju poprzecznego pryzm. Adaptacje zębów stanowiły ewolucyjną odpowiedź trąbowców na zmiany paleoklimatu, które zmuszały zwierzęta do migracji, zajmowania nowych siedlisk i dostosowywania ich diety do warunków panujących w paleoekosystemach. Wyniki projektu wskazują, że szkliwo, ze swoją wyjątkową odpornością na zmiany chemiczne pochodzenia zewnętrznego, stanowi atrakcyjny materiał, spośród innych dostępnych zmineralizowanych tkanek twardych zwierząt, dla badań paleontologicznych i dostarcza bogactwa informacji pomocnych w rozumieniu ewolucji zwierząt i ich mechanizmów adaptacyjnych oraz rekonstukcji paleoklimatu i paleośrodowisk.
W trzecim i zarazem ostatnim projekcie przedstawionym w tej pracy, zastosowano ultramałe nanocząstki złota, aby badać oddziaływania między komórkami bakterii (szczepami Escherichia coli), a nieorganicznymi nanonośnikami. Wykorzystano tutaj znakomite możliwości chemicznej modyfikacji powierzchni nanocząstek, aby kowalencyjnie udekorować je fotostabilnymi barwnikami. Projekt zakładał zastosowanie nanocząstek złota, w klasterowym zakresie wielkości, tak aby umożliwić ich wychwyt przez autofluorescencyjne komórki bakterii. Dla uzyskania wysokiej jakości obrazowania prób w trójwymiarze, wykorzystano zaawansowane techniki mikroskopii fluorescencyjnej, takie jak mikroskopia konfokalna i mikroskopia superrozdzielczości. Wychwyt nanocząstek przez komórki bakterii został wykazany we wszystkich badanych eksperymentalnych konfiguracjach. Inkubacja z nanocząstkami nie miała również negatywnego wpływu na żywotność kultur bakterii, w tym komórek, które wychwyciły nanocząstki (komórki pozytywne), potwierdzając tym samym brak cytotoksyczności ultramałych nanocząstek złota. Wydajność wychwytu nanocząstek przez bakterie była zależna od stężenia cząstek w środowisku. Wykazano również przewagę zastosowania barwników sprzężonych z nanocząstkami nad wolnymi barwnikami, w tego rodzaju badaniach mikrobiologicznych. Ultramałe nanocząstki złota charakteryzowała zdolność penetracji ściany komórkowej bakterii, bez działania letalnego wobec komórek, i duże możliwości chemicznej modyfikacji, co czyni je potencjalnymi kandydatami w leczeniu infekcji bakteryjnych, np. po sprzężeniu z odpowiednimi substancjami przeciwdrobnoustrojowymi. Zaprezentowane wyniki potwierdzają, że znakowane fluorescencyjnie ultramałe nanocząstki złota przyczyniają się do lepszego zrozumienia natury oddziaływań między nanocząstkami i komórkami prokariotycznymi, która jest słabiej poznana niż w przypadku komórek eukariotycznych, szczególnie w kwestii ich nieletalnego wychwytu.