Unraveling mechanisms of microbial community assembly using naturally replicated microbiomes
In the field of microbial ecology, it is challenging to study mechanisms that affect microbial communities in situ. Primarily, this is due to the high complexity of environmental data. Scientist have always to deal with several unknown parameters while handling environmental samples. However, the Pitch Lake water droplets provide extraordinary model systems that are anthropogenically unaffected and naturally occurring. The microliter-sized water droplets are dispersed in the heavy oil of the Pitch Lake in Trinidad and Tobago and contain different and complex microbial community compositions. They provide a naturally less complicated system because numerous droplets can be sampled at the same time, each representing an independent natural replicate, and because on the first view all droplets have been exposed to the same environmental conditions within the oil reservoir.
In this thesis, multiple microbial communities inhabiting the Pitch Lake water droplets were studied to unravel basic mechanisms that play a role in microbial community assembly and how these shape microbial communities. Dispersal was excluded as possible assembly process for the water droplets. A fluid-dynamics model applied to the Pitch Lake oil predicted that it is highly unlikely that droplets fuse amongst themselves. Individual cells are unlikely to disperse between the water droplets due to the low water activity of the oil. Computational modelling manifested that ecological drift and speciation on basis of 16S rRNA amplicon sequences are unimportant for the microbial assembly processes in the Pitch Lake droplet microbial communities. Because dispersal, ecological drift and speciation processes were ruled out we conclude that mainly selection has shaped the microbial community patterns determined by 16S rRNA gene amplicon sequencing. Indeed, we provide experimental evidence that selection is shaping the communities. Ion chromatography measurements of single water droplets demonstrated that geochemistry within the water droplets is variable and that chloride, potassium and sulfide are selective parameters which significantly influence microbial communities in terms of composition and diversity. Statistical analyses were applied to prove that the Pitch Lake microbial communities respond threshold-regulated rather than gradually to the droplet’s chloride concentrations. Once, chloride concentrations exceeded 57.3 mM, the microbial community composition abruptly shifted to less diverse and more uneven.
Besides, the water droplets were further characterized as densely populated microhabitats of actively oil degrading microbial communities. Each droplet community was inhabited by a rather large core community constituting 68 ± 20 % of the total community consisting of 18 OTUs. For investigating the life in a water droplet following methods were applied: computer tomography 3D-imaging of water droplets entrapped in oil, quantitative real-time PCR for the determination of the 16S rRNA gene copy numbers, microscopic cell counting, ATP-measurement, LIVE/DEAD staining, biofilm visualization, anaerobic cultivation and reverse
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stable isotope labeling for detection of microbial CO2 production. Moreover, such water droplet microhabitats were proved to also occur in two other heavy oil seeps located in the USA and by that thousands of kilometers away from the Pitch Lake in Trinidad and Tobago. Before it was not clear if the water droplets were unique for the heavy oil of the Pitch Lake or a more general characteristic of heavy oil reservoirs. These water droplets were shown to enlarge the total surface at which oil degradation can take place inside an oil reservoir and thus far away from the oil-water-transition-zone (OWTZ). The OWTZ is located below an oil reservoir and was up to now recognized as the major location where oil biodegradation is taking place.
We observed high in situ formate concentrations of ~ 2.37 mM in half of the investigated water droplets. We investigated if the high formate concentrations might inhibit sulfate reduction and if this observation can be extrapolated to sulfate-reducing microorganisms. For this we combined the observations from the Pitch Lake water droplets with laboratory experiments on sulfate-reducing strains. The results demonstrated that high formate concentrations can slow down the growth rates or delay the onsets of growth and sulfate reduction depending on the organism’s energy metabolism. This helped to conclude that the sulfate-reducing microorganisms in the Pitch Lake water droplets are most likely inhibited by formate. These are interesting results because sulfate reducing organisms produce hydrogen sulfide which causes lower oil quality and corrosion of oil pipelines. By that oil industry is confronted with a lot of costs, which they try to decrease by targeted inhibition of sulfate reducing organisms. The application of formate during oil production might display a cost-efficient and environmentally friendly alternative to other inhibition methods of microbial sulfate-reduction.
The work presented in this thesis advances the knowledge on the water droplet microhabitats entrapped in heavy oil. It emphasizes that the water droplets provide a very interesting natural model system for studying undisturbed and environmentally less complex microbial communities that are mainly driven by selective parameters and respond threshold-regulated to salinity. Selection alone can produce core communities that represent a large proportion of the total community but with varying abundances of single core members. Moreover, in future studies natural environments might be considered as more heterogeneous in terms of geochemical properties. The results imply that also water droplets should be considered in future calculations regarding our worldwide oil biodegradation rates and thus the economically available oil deposits.
Im Forschungsgebiet der mikrobiellen Ökologie stellt die Untersuchung der tatsächlich ablaufenden in situ Prozesse und deren Einfluss auf die natürlich vorkommenden mikrobiellen Gemeinschaften eine große Herausforderung dar. Dieses Problem besteht, weil Umweltbedingungen sehr komplex sein können. Aufgrund der Komplexität von Umweltproben müssen Wissenschaftler:innen oft mit einer Großzahl an unbekannten Parametern rechnen und mit ihnen umgehen können. Die Pitch Lake Wassertropfen stellen hierbei ein besonderes Modelsystem dar, da diese natürlich vorkommen und frei von anthropogenen Einflüssen sind. Diese Wassertropfen bestehen lediglich aus wenigen Mikrolitern Wasser und liegen dispergiert im Schweröl des Pitch Lakes in Trinidad und Tobago vor. Die Wassertropfen werden von komplexen und unterschiedlichen mikrobiellen Gemeinschaften bewohnt.
Weil jederzeit mehrere Wassertropfen aus demselben Öl beprobt werden können und weil alle beprobten Wassertropfen auf den ersten Blick exakt den gleichen Umweltbedingungen ausgesetzt waren, stellen diese natürlich replizierte Lebensgemeinschaften dar.
Um die fundamentalen Mechanismen zu erforschen welche die Zusammensetzung mikrobieller Gemeinschaften kontrollieren, wurde in der vorliegenden Doktorarbeit eine Vielzahl der in den Wassertropfen lebenden mikrobiellen Gemeinschaften untersucht.
Mittels eines numerischen Modells für Strömungsmechanik konnte gezeigt werden, dass es sehr unwahrscheinlich ist, dass Wassertropfen innerhalb des Öls miteinander verschmelzen. Das bedeutet, dass zwischen den Wassertropfen keine Verteilung (dispersal) oder Vermischung der Mikroorganismen stattfinden kann. Dass einzelne Zellen zwischen den Tropfen ausgetauscht werden, ist aufgrund der geringen Wasseraktivität des Öls unwahrscheinlich. Somit konnte ein wichtiger grundlegender Prozess, der normalerweise eine wichtige Rolle in der Zusammenkunft von Mikroorganismen einnimmt, für die Lebensgemeinschaften in den Pitch Lake Wassertropfen ausgeschlossen werden.
Eine weitere Computersimulation konnte zudem zeigen, dass auch ökologischer Drift von Arten (ecological drift) und Artbildung (speciation) auf Basis von 16S rRNA Amplikon Sequenzen innerhalb der Wassertopfen irrelevant für die Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaften ist. Durch den Ausschluss von Verteilung (dispersal), ökologischem Drift und Artbildung (speciation) konnte konkludiert werden, dass selektive Prozesse (selection) für die Zusammensetzung der Gemeinschaften ausschlaggebend gewesen sein müssen.
Tatsächlich konnten experimentelle Daten beweisen, dass Selektion die mikrobiellen Gemeinschaften in den Wassertropfen beeinflusst. Mittels Ionenchromatographie-Messungen von einzelnen Tropfen konnte gezeigt werden, dass diese sich in ihren geochemischen Zusammensetzungen unterscheiden. Chlor-, Kalium- und Sulfat-Ionen hatten einen signifikanten Einfluss auf die mikrobiellen Gemeinschaften und wurden somit als selektive Parameter identifiziert. Durch statistische Analysen wurde ersichtlich, dass die Wassertropfen-
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Gemeinschaften sich in Zusammensetzung und Diversität änderten, sobald die Salinität über einem Schwellenwert von 57.3 mM Chloridionen lag. Ein gradueller Einfluss von Chlorid-Ionen auf die Gemeinschaften wurde nicht gefunden.
Zusätzlich wurde innerhalb dieser Arbeit gezeigt, dass die Wassertropfen eingeschlossen im Schweröl keine Besonderheit des Pitch Lakes in Trinidad und Tobago sind, sondern auch in zwei weiteren Schweröl-Reservoiren, tausende Kilometer entfernt, in den USA vorkommen. Außerdem wurde das natürliche Potential mikrobiellen Öl Abbaus innerhalb der Wassertropfen untersucht und gezeigt, dass die Oberfläche, an welcher Öl Abbau stattfinden kann, durch die Oberfläche der Wassertropfen vergrößert wird. Damit findet Öl Abbau weit weg von der Öl-Wasser-Übergangszone (oil-water-transition-zone) und somit innerhalb eines Ölreservoirs statt. Die Öl-Wasser-Übergangszone befindet sich für gewöhnlich unterhalb eines Ölreservoirs und wurde bis jetzt als Hotspot biologischen Öl Abbaus wahrgenommen.
Das mikrobielle Leben im Wassertropfen wurde zudem genauer charakterisiert. Es wurde festgestellt, dass jede Tropfengemeinschaft von einer relativ großen Kerngemeinschaft (core community) besiedelt wurde. 18 OTUs waren feste Mitglieder jeder Gemeinschaft und machten dabei 68 ± 20 % der Gesamtgemeinschaft aus. Zur Untersuchung des Lebens im Wassertropfen eingeschlossen in Öl kamen folgende Methoden zu Anwendung: 3D-Computertormographie-Aufnahmen von Wassertropfen im Öl, quantitative real-time PCR zur Bestimmung der 16S rRNA Genkopiezahlen, mikroskopische Zellzählung, ATP-Messungen, Lebend/Tot (LIVE/DEAD) Färbungen, Biofilm-Visualisierung, anaerobe Kultivierung und Inverse-Isotopenmarkierung Messungen (reverse stable isotope labeling) zu Bestimmung von mikrobiell gebildetem CO2. Unsere Analysen zeigen, in welcher Häufigkeit und mit welchen Volumina die Tropfen im Öl verteilt vorliegen und dass die Mikroorganismen in dicht besiedelten Gemeinschaften in den Wassertropfen leben, potentiell biofilmartige Strukturen bilden können und dort Öl abbauen.
Überraschenderweise wurden hohe und stabile in situ Formiat-Konzentrationen von ~ 2.37 mM in der Hälfte der untersuchten Wassertropfen gefunden. Daher wurde untersucht, ob diese für eine Inhibition von Sulfat-reduzierenden Mikroorganismen in den Wassertropfen verantwortlich sein könnten. Um dies zu ergründen, wurden Beobachtungen von den Pitch Lake Wassertropfen mit Laborexperimenten an Sulfat-reduzierenden Reinkulturen verbunden. Die Ergebnisse offenbarten, dass hohe Formiat-Konzentrationen, abhängig vom Energiemetabolismus des untersuchten bakteriellen Stamms, die Wachstumsrate verlangsamen können oder sogar den Wachstumsstart sowie den Startpunkt der Sulfat Reduktion verzögern können. Die Experimente haben gezeigt, dass es gut möglich ist, dass die hohen Formiat-Konzentrationen in den Wassertropfen einen inhibierenden Einfluss auf die Sulfat-reduzierenden Pitch Lake Mikroorganismen haben. Dabei handelt es sich um interessante Ergebnisse, da Sulfat-reduzierende Mikroorganismen Schwefelwasserstoff
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produzieren, welcher die Ölqualität mindert und für die Korrosion von Rohrleitungen in der Ölproduktion verantwortlich ist. Hieraus ergeben sich für die Ölindustrie erhöhte Kosten. Durch die gezielte Inhibition von Sulfat-reduzierenden Mikroorganismen versucht die Industrie jedoch, die Kosten niedriger zu halten. Der Einsatz von Formiat könnte perspektivisch eine kostengünstige und umweltfreundliche Alternative zu bisherigen Methoden zur Inhibition von Sulfat-reduzierenden Mikroorganismen darstellen.
Die vorliegende Arbeit hat das bisherige Wissen über das mikrobielle Leben im Wassertopfen, eingeschlossen in Schweröl, deutlich erweitert. Die mikrobiellen Gemeinschaften im Wassertropfen, stellen ein sehr interessantes Modelsystem dar. Das Besondere an Ihnen ist, dass die mikrobiellen Gemeinschaften hauptsächlich durch selektive Prozesse beeinflusst werden und andere mögliche gemeinschaftsformende Prozesse ausgeschlossen werden konnten. Salinität konnte als ein wichtiger selektiver Prozess identifiziert werden. Auf Salinität reagieren die Gemeinschaften Schwellenwert-reguliert. Außerdem sind die Wassertropfen Gemeinschaften anthropogen ungestört. Selektion führt zu vorhersagbaren mikrobiellen Gemeinschaften mit Kernbewohnern (core members), die einen großen Teil der Gesamtgemeinschaft einnehmen. Die einzelnen Stammbewohner sind dabei in ihrer individuellen Anzahl zwischen den Gemeinschaften variabel. Zudem sollte die natürliche Umgebung von Mikroorganismen in Bezug auf geochemische Parameter in zukünftigen Studien als heterogener betrachtet werden. Bei der Erstellung von Hochrechnungen, die die weltweiten biologischen Ölabbauraten und damit die ökonomisch verfügbaren Ölressourcen betreffen, sollten die im Ölreservoir eingeschlossenen Wassertropfen zukünftig berücksichtigt werden.