Trematode diversity in freshwater ecosystems : from individuals to communities

Biodiversity is declining worldwide at a rapid pace. Despite the alarming rate of biodiversity loss, the predictions made to date are probably still rather conservative, as a large proportion of the species on our planet have not yet been officially described (Singh 2002; Poulin and Morand 2004; Barnosky et al. 2011; Mora et al. 2011; Engel et al. 2021). Despite conservative estimates, a multitude of studies predict that the rate of biodiversity loss will accelerate in the future, exacerbated by anthropogenic impact (e.g., De Vos et al. 2017; Diaz et al. 2019; Andermann 2020; Bradshaw et al. 2021). Human activities have altered large areas of our planet (Sanderson et al. 2002; Halpern et al. 2008; Birk et al. 2020), with freshwater habitats being particularly affected by degradation and species loss (Birk et al. 2020; Tickner et al. 2020). Changes in water usage, distribution, and flow, combined with changes in climate and land-use, and a rapid human population increase, have detrimental consequences for biodiversity and ecosystem services (Elmhagen et al. 2015; Albert, 2021). Although the threat to our planet from the loss of biodiversity and intact ecosystems rivals that from climate change, it remains difficult to find a common approach to the protection of ecosystems, plants and animals that will effectively address the biodiversity crisis in the long term.

Besides our moral duty to care for the well-being of all organisms living on this planet, there are several reason why biodiversity conservation, including that of parasites, is critical (Poulin and Morand 2004). Parasites, like other organisms, are part of the ecosystem and fulfill important roles, for instance, modulating ecological speciation (Karvonen and Seehausen 2012; Betts et al. 2018) acting as ecosystem engineers (Thomas et al. 1999), regulating host populations (Hudson et al. 2006; Lefèvre et al. 2009; Frainer et al. 2018), and altering predator-prey dynamics (Lafferty and Morris 1996; Mouritsen and Poulin 2002). Although, parasitism is regarded as one of the most successful and ubiquitous life forms (Dobson et al. 2008; Poulin 2014; Carlson et al. 2019), our understanding of parasites and their critical roles in ecosystems is still very limited, particularly for those having complex life cycle, such as digenean trematodes. Digenean trematodes belong to one of the most diverse and widespread groups of metazoan parasites on the planet (Esch et al. 2002). Due to their complex life cycles, involving mostly two or three hosts, including snails, digenean trematodes may be particularly suitable as bioindicators to assess changes in environmental conditions and ecosystem functioning (Vidal-Martnez et al. 2010; Shea et al. 2012; Sures et al. 2017b). However, knowledge about their distribution, life cycle, and taxonomic relationships is relatively incomplete (Poulin and Morand 2004; Poulin 2014; Sures et al. 2017a; Jorge and Poulin 2018). Given the significance of parasites in ecosystems and the current gap of knowledge relative to their diversity and ecology, we are unable to fully understand and consequently preserve ecosystems effectively. Moreover, in view of enhanced biodiversity loss, a lack of these fundamental information may also imply that many parasite species may become extinct before even being detected. Thus, the knowledge of their role in the ecosystem may be lost forever.

The aim of this thesis is to explore the yet unknown trematode diversity in European freshwater ecosystems at the species, host, and ecosystem levels. Hence aquatic molluscs, the first intermediate host of trematodes, were collected in 2016, 2017, and 2019 at several sampling sites in three German rivers: the Ruhr, the Lippe, and the Rhine. Among the snails collected were representatives of 20 different species from eight families, of which members of the families Lymnaeidae and Planorbidae were the most abundant. Additionally, 15 European minnows (Phoxinus phoxinus) from the river Ruhr were examined for infections with metacercariae. Trematode stages were identified by morphological characteristics and, when necessary and appropriate, by molecular methods.

The individual studies of this thesis reveal exceptional and novel insights into parasite diversity at different levels. At the species level Diplostomum phoxini was characterised morphologically and molecularly using cercariae isolates from the gastropod Ampullaceana balthica and metacercariae from P. phoxinus. Phylogenetic analyses targeting the cytochrome c oxidase subunit 1 (cox1) gene yielded 44 molecularly characterised species and genetically distinct lineages of Diplostomum and resulted in a re-identification/re-classification of 98 isolates, a redefinition of the composition of the D. baeri and D. mergi species complexes, and an actualised nomenclature for the molecularly characterised species/lineages of Diplostomum (Schwelm et al. 2021a; Chapter I).

In Chapter II, the trematode diversity at the level of the first intermediate host was investigated. For this purpose, Bithynia tentaculata, a member of the family Bithynidae, for which little information is available on its trematode communities despite its wide distribution in European freshwater systems, was specifically studied. Overall, B. tentaculata showed a high trematode prevalence and molecular and morphological data analysis revealed a species-rich trematode fauna comprising 20 species belonging to 10 families demonstrating a unique species composition when compared to well-studied snail host families, such as Lymnaeidae and Planorbidae (Schwelm et al. 2020; Chapter II).

In Chapter III, a protected natural freshwater system was investigated to assess the trematode diversity on the ecosystem level. In view of the ongoing destruction of habitats and the biodiversity crisis, protected areas are important refuges for wildlife and thus also for parasites that use those organisms as hosts. In total, fifteen snail species were studied, which revealed a high trematode species richness of 40 species, with a substantial proportion of species with complex life cycles (Schwelm et al. 2021b; Chapter III).

In this work, essential aspects, such as the importance of taxonomic resolution, reconstruction of life-cycles and the important role of parasites in food webs and ecosystem health were discussed. Taxonomic resolution is a cornerstone for reliable estimates of parasite diversity, extinction rates, life cycle reconstruction and food web assessment. Within this thesis, it could be demonstrated that the application of molecular methods can contribute significantly to the clarification of species relationships. Although, no cryptic diversity could be detected within this study, two species complexes could be redefined, numerous isolates could be reclassified, and isolates of the cercariae of A. balthica and metacercariae of P. phoxinus were matched, thus underlining the host specificity of the parasite for its second intermediate fish host. The study of the previously neglected host B. tentaculata revealed a unique trematode community compared to well studied snail host families. In total, 20 species could be identified, some of which could only be determined at genus or family level due to a lack of identification literature and comparative isolates from GenBank. This highlights the importance of collecting molecular reference material anchored in reliably determined and detailed morphological descriptions. The reconstruction of life cycles, which can provide valuable insights into trophic interactions and local free-living diversity (Hechinger et al. 2007; Byers et al. 2010; Shea et al. 2012), also relies on reliable identified species. Based on the identified parasites, statements could be made about trophic relationships and the presence of free-living organisms in the habitat studied, e.g., bats and herons. On the other hand, parasites have also been detected whose life cycle we still know too little about which shows the patchy and heterogeneous data situation on parasites and their life cycles (Poulin and Morand 2004; Kudlai et al. 2015; Sures et al. 2017a). Parasites play crucial roles in the ecosystem equilibrium, for example by contributing to diversity, influencing host population density and predator prey interactions. In this thesis, the brain dwelling metacercariae D. phoxini was studied, which is known for altering the flight behaviour of its host and therefore, most likely influencing interaction strength between its intermediate fish host and its potential final host. Whilst the characteristics of digenean trematodes discussed in this dissertation allow for a detailed and comprehensive analysis of these parasites at all levels of diversity, hurdles and knowledge gaps have also been identified that impede the use of parasites in biodiversity assessments and prevent their great potential as bioindicators from being fully realised. To be able to benefit from this opportunity in the future, it would be advisable to focus on collecting life cycle data based on reliably molecularly and morphologically determined specimens, which are collected and made available in large-scale databases.

In conclusion, this work has shown that trematodes contribute in multiple ways to biodiversity, energy flow and the structure of the ecosystems in which they occur. The impending loss of biodiversity will not only result in a significant decline of charismatic megafauna diversity, but it will also eradicate their parasites, impacting undiscovered essential and functional components of the ecosystem. Although our findings are merely glimpses, they open the door to further developments in parasite taxonomy and ecological parasitology, as well as prompting a rethinking of methodological approaches and conservation regimes. Despite the fact that we still have a long way to go before we obtain a more holistic view of their great diversity and functional roles in ecosystems, we should aim to include parasites in our conception of biodiversity. Consequently, the current thesis provides the base for an important step towards including parasites in ecosystem studies and biodiversity conservation efforts. We will only be able to successfully and sustainably protect an ecosystem if we fully comprehend the underlying functions of all its members.

Die biologische Vielfalt nimmt weltweit in rasantem Tempo ab. Trotz der alarmierenden Verlustrate sind die bisherigen Prognosen wahrscheinlich noch recht konservativ, da ein großer Teil der Arten auf unserem Planeten noch nicht offiziell beschrieben wurde (Singh 2002; Poulin und Morand 2004; Barnosky et al. 2011; Mora et al. 2011; Engel et al. 2021). Trotz vorsichtiger Schätzungen sagen zahlreiche Studien voraus, dass sich der Verlust der biologischen Vielfalt in Zukunft beschleunigen wird, verstärkt durch anthropogene Aktivitäten (z. B. De Vos et al. 2017; Diaz et al. 2019; Andermann 2020; Bradshaw et al. 2021). Menschliche Aktivitäten haben große Gebiete unseres Planeten verändert (Sanderson et al. 2002, Halpern et al. 2008, Birk et al. 2020), wobei Süßwasserlebensräume besonders von Degradation und Artenverlust betroffen sind (Birk et al. 2020; Tickner et al. 2020). Veränderungen in der Wassernutzung, -verteilung und -strömung haben in Verbindung mit Klima- und Landnutzungsänderungen und einem raschen Anstieg der menschlichen Bevölkerung nachteilige Folgen für die biologische Vielfalt und die Ökosystemleistungen (Elmhagen et al. 2015; Albert, 2021). Obwohl die Bedrohung unseres Planeten durch den Verlust der biologischen Vielfalt und intakter Ökosysteme derjenigen durch den Klimawandel in nichts nachsteht, ist es nach wie vor schwierig, einen gemeinsamen Ansatz für den Schutz von Ökosystemen, Pflanzen und Tieren zu finden, mit dem die Biodiversitätskrise auf lange Sicht wirksam angegangen werden kann.

Neben unserer moralischen Pflicht, für das Wohlergehen aller auf diesem Planeten lebenden Organismen zu sorgen, gibt es mehrere Gründe, warum die Erhaltung der biologischen Vielfalt, einschließlich der von Parasiten, entscheidend ist (Poulin und Morand 2004). Parasiten sind, wie andere Organismen auch, Teil des Ökosystems und erfüllen wichtige Aufgaben, wie z. B. die Einflussnahme auf die ökologische Artbildung (Karvonen und Seehausen 2012; Betts et al. 2018), die Funktion eines Ökosystemingenieurs (Thomas et al. 1999), die Regulierung von Wirtspopulationen (Hudson et al. 2006; Lefèvre et al. 2009; Frainer et al. 2018) und die Veränderung von Räuber-Beute-Dynamiken (Lafferty und Morris 1996; Mouritsen und Poulin 2002). Obwohl Parasitismus als eine der erfolgreichsten und allgegenwärtigsten Lebensformen gilt (Dobson et al. 2008; Poulin 2014; Carlson et al. 2019), ist unser Verständnis von Parasiten und ihrer entscheidenden Rolle in Ökosystemen immer noch sehr begrenzt, insbesondere bei Parasiten mit komplexem Lebenszyklus, wie z. B. digenenen Trematoden. Digene Trematoden gehören zu einer der vielfältigsten und am weitesten verbreiteten Gruppen metazoischer Parasiten auf dem Planeten (Esch et al. 2002). Aufgrund ihrer komplexen Lebenszyklen, an denen meist zwei oder drei Wirte, einschließlich Schnecken, beteiligt sind, eignen sich digene Trematoden besonders gut als Bioindikatoren zur Bewertung von Veränderungen der Umweltbedingungen und der Funktionsweise von Ökosystemen (Vidal-Martnez et al. 2010; Shea et al. 2012; Sures et al. 2017b). Das Wissen über ihre Verbreitung, ihren Lebenszyklus und ihre taxonomischen Beziehungen ist jedoch relativ unvollständig (Poulin und Morand 2004; Poulin 2014; Sures et al. 2017a; Jorge und Poulin 2018). Angesichts der Bedeutung von Parasiten in Ökosystemen und der derzeitigen Wissenslücke in Bezug auf ihre Vielfalt und Ökologie sind wir nicht in der Lage, Ökosysteme vollständig zu verstehen und folglich langfristig effektiv zu erhalten. In Anbetracht des zunehmenden Verlusts an biologischer Vielfalt kann ein Mangel an diesen grundlegenden Informationen auch bedeuten, dass viele Parasitenarten aussterben, bevor sie überhaupt entdeckt werden. Damit könnte das Wissen über ihre Rolle im Ökosystem für immer verloren gehen.

Ziel dieser Arbeit ist es, die bisher unbekannte Trematodenvielfalt in europäischen Süßwasserökosystemen auf der Ebene der Arten, der Wirte und des Ökosystems zu erforschen. Dazu wurden in den Jahren 2016, 2017 und 2019 aquatische Schnecken, die Zwischenwirte der Trematoden, an mehreren Probenahmestellen in den Flüssen Ruhr, Lippe und Rhein gesammelt. Bei den gesammelten Schnecken handelte es sich um Vertreter von 20 verschiedenen Arten aus acht Familien, von denen Mitglieder der Familien Lymnaeidae und Planorbidae am häufigsten vorkamen. Zusätzlich wurden 15 Elritzen (Phoxinus phoxinus) aus der Ruhr auf Infektionen mit Metazerkarien untersucht. Die Trematodenstadien wurden anhand morphologischer Merkmale und, wenn nötig und sinnvoll, mit molekularen Methoden identifiziert.

Die einzelnen Studien dieser Arbeit zeigen außergewöhnliche und neue Einblicke in die Parasitendiversität auf verschiedenen Ebenen. Auf Artniveau wurde Diplostomum phoxini morphologisch und molekularbiologisch charakterisiert, indem Zerkarienisolate aus der Schnecke Ampullaceana balthica und Metazerkarien aus der Elritze P. phoxinus verwendet wurden. Phylogenetische Analysen, die auf das Cytochrom c-Oxidase Untereinheit 1 (cox1) Gen abzielten, ergaben 44 molekular charakterisierte Arten und genetisch unterschiedliche Linien von Diplostomum und führten zu einer Re-Identifizierung/Reklassifizierung von 98 Isolaten, einer Neudefinition der Zusammensetzung der D. baeri und D. mergi Artenkomplexe und einer aktualisierten Nomenklatur für die molekular charakterisierten Arten/Linien von Diplostomum (Schwelm et al. 2021a; Kapitel I).

In Kapitel II wurde die Trematodenvielfalt auf der Ebene des ersten Zwischenwirts untersucht. Zu diesem Zweck wurde gezielt Bithynia tentaculata, ein Vertreter der Familie Bithynidae, untersucht, über den trotz seiner weiten Verbreitung in europäischen Süßwassersystemen nur wenige Informationen über seine Trematodengemeinschaften vorliegen. Insgesamt zeigte B. tentaculata eine hohe Trematodenprävalenz, und die molekulare und morphologische Datenanalyse ergab eine artenreiche Trematodenfauna bestehend aus 20 Arten (10 Familien), welche eine einzigartige Artenzusammensetzung im Vergleich zu gut untersuchten Schneckenwirtsfamilien, wie Lymnaeidae und Planorbidae, aufweisen (Schwelm et al. 2020; Kapitel II).

In Kapitel III wurde ein geschütztes natürliches Süßwassersystem untersucht, um die Trematodenvielfalt auf der Ebene des Ökosystems zu bewerten. Angesichts der fortschreitenden Zerstörung von Lebensräumen und der Krise der biologischen Vielfalt sind Schutzgebiete wichtige Rückzugsgebiete für Wildtiere und damit auch für Parasiten, die diese Organismen als Wirte nutzen. Insgesamt wurden fünfzehn Schneckenarten untersucht und ein hoher Trematoden-Artenreichtum von 40 Arten festgestellt, mit einem hohen Anteil an Arten mit komplexen Lebenszyklen (Schwelm et al. 2021b; Kapitel III).

In dieser Arbeit werden wesentliche Aspekte, wie die Bedeutung der taxonomischen Auflösung, die Rekonstruktion von Lebenszyklen und die wichtige Rolle von Parasiten in Nahrungsnetzen und der Gesundheit von Ökosystemen erörtert. Die taxonomische Auflösung ist ein Grudstein für zuverlässige Schätzungen der Parasitenvielfalt, der Aussterberaten, der Rekonstruktion von Lebenszyklen und der Bewertung von Nahrungsnetzen. Im Rahmen dieser Arbeit konnten gezeigt werden, dass die Anwendung molekularer Methoden wesentlich zur Klärung von Artbeziehungen beitragen kann. Obwohl wir im Rahmen unserer Studie keine kryptische Diversität nachweisen konnten, gelang es, auf der Grundlage der durchgeführten Analysen zwei Artenkomplexe neu zu definieren, zahlreiche Isolate neu zu klassifizieren und Isolate der Zerkarien von A. balthica und Metacercarien von P. phoxinus einander zu zuordnen, was die Wirtsspezifität des Parasiten für seinen zweiten Fischzwischenwirt unterstreicht. Die Untersuchung des bisher vernachlässigten Wirts B. tentaculata ergab eine einzigartige Trematodengemeinschaft im Vergleich zu gut untersuchten Wirtsfamilien, wie den Lymnaeidae und Planorbidae. Insgesamt wurden 20 Arten, von denen einige aufgrund fehlender Bestimmungsliteratur und vergleichbarer Isolate aus GenBank nur auf Gattungs- oder Familienebene bestimmt werden konnten, identifiziert. Dies verdeutlicht, wie wichtig es ist, molekulares Referenzmaterial zu sammeln, das sich auf verlässliche und detaillierte morphologische Beschreibungen stützt. Die Rekonstruktion von Lebenszyklen, die wertvolle Einblicke in trophische Interaktionen und die lokale freilebende Vielfalt liefern kann (Hechinger et al. 2007; Byers et al. 2010; Shea et al. 2012), hängt ebenfalls von zuverlässig identifizierten Arten ab. Anhand der identifizierten Parasiten konnten Aussagen über trophische Beziehungen und das Vorhandensein freilebender Organismen im untersuchten Habitat, z. B. Fledermäuse und Reiher, getroffen werden. Andererseits wurden auch Parasiten gefunden, über deren Lebenszyklus man noch zu wenig weiß, was die lückenhafte und heterogene Datenlage zu Parasiten und ihren Lebenszyklen unterstreicht (Poulin und Morand 2004; Kudlai et al. 2015; Sures et al. 2017a). Parasiten spielen eine entscheidende Rolle im Gleichgewicht des Ökosystems, indem sie beispielsweise zur Diversität beitragen, die Wirtspopulationsdichte und die Räuber-Beute-Interaktionen beeinflussen. In dieser Arbeit untersuchten wir die hirnparasitierenden Metazerkarien von D. phoxini, über die man weiß, dass sie das Fluchtverhalten ihres Wirts verändern und damit höchstwahrscheinlich die Interaktionsstärke zwischen ihrem Fischzwischenwirt und ihrem potenziellen Endwirt beeinflussen.

Obwohl die in dieser Dissertation erörterten Charakteristika von digenen Trematoden eine detaillierte und umfassende Analyse dieser auf allen Diversitätsebenen ermöglichen, wurden auch Hürden und Wissenslücken festgestellt, die den Einsatz von Parasiten bei der Bewertung der biologischen Vielfalt erschweren und verhindern, dass ihr großes Potenzial als Bioindikatoren voll ausgeschöpft werden kann. Um diese Möglichkeit in Zukunft besser nutzen zu können, wäre es ratsam, sich auf die Erhebung von Lebenszyklusdaten zu konzentrieren, die auf zuverlässig molekular und morphologisch bestimmten Exemplaren basieren, die gesammelt und in groß angelegten Datenbanken verfügbar gemacht werden.

Insgesamt konnten in dieser Doktorarbeit gezeigt werden, dass Trematoden in mehrfacher Hinsicht zur Artenvielfalt, zum Energiefluss und zur Struktur der Ökosysteme, in denen sie vorkommen, beitragen. Der drohende Verlust der Artenvielfalt wird nicht nur zu einem erheblichen Rückgang der Vielfalt charismatischer Megafauna führen, sondern auch ihre Parasiten ausrotten, was sich auf bisher unzureichend untersuchte, aber wichtige und funktionelle Komponenten des Ökosystems auswirken wird. Auch wenn die Erkenntnisse dieser Arbeit nur einen kleinen Einblick gewähren, öffnen sie die Tür für weitere Entwicklungen in der Taxonomie der Parasiten und der ökologischen Parasitologie und regen dazu an, methodische Ansätze und Schutzmaßnahmen zu überdenken. Trotz der Tatsache, dass wir noch einen weiten Weg vor uns haben, bis wir einen ganzheitlicheren Blick auf ihre große Vielfalt und ihre funktionelle Rolle in Ökosystemen erhalten werden, sollten wir anstreben, Parasiten in unser Konzept der biologischen Vielfalt einzubeziehen. Die vorliegende Arbeit bildet daher die Grundlage für einen wichtigen Schritt zur Einbeziehung von Parasiten in die Erforschung von Ökosystemen und die Bemühungen zur Erhaltung der biologischen Vielfalt. Wir werden nur dann in der Lage sein, ein Ökosystem erfolgreich und nachhaltig zu schützen, wenn wir die zugrundeliegenden Funktionen all seiner Mitglieder vollständig verstehen.


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