Die klinische Verwendung und der Nutzen von extrazellulären Vesikeln in der pädiatrischen akuten myeloischen Leukämie
RealTime-PCR oder GeneScan basierter Fragmentlängenanalyse auf mögliche Mutationen untersucht. Hierbei zeigte sich, dass nur die für die Mutation positive Zelllinie Signale in den Assays zeigte. Im Anschluss wurden die extrazellulären Vesikel der Patientenproben gewonnen. Aus den EVs von insgesamt 29 ausgewählten Patienten wurde nun entweder die DNA und / oder RNA gewonnen und quantifiziert. Die RNAAnalyse der Mutationen zeigte, dass die NPM1-Mutation in sieben Patienten zum Zeitpunkt der Diagnose zu finden war. Lediglich in zwei Patientenproben war dies nicht möglich. In den Patientenproben mit FLT3-ITD Mutation war es möglich, die Mutation
in allen Initialproben zu detektieren. Dennoch waren die Mutationen in den Proben nach Therapiebeginn nicht länger detektierbar, was nicht immer in Korrelation mit den Ergebnissen der routinemäßig durchgeführten genomischen DNA-Analyse stand, die in unserem diagnostischen AML-Labor durchgeführt wird. Weitere 16 Patienten wurden mittels Gene-Scan basierter Fragmentlängenanalyse hinsichtlich ihrer Mutationen in der EV-DNA untersucht. Auch in diesem Assay zeigten sich die in der gDNA bereits
gefundenen Mutationen in der EV-DNA der Initialproben. Lediglich in einer Probe war keine Mutation detektierbar. In vier der 16 gemessenen Proben war es zudem möglich, in einer Folgeprobe die entsprechende Mutation zu detektieren. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass es uns gelang, in fast allen Proben zur Diagnosestellung die Mutation in der EV-RNA bzw. EV-DNA zu finden, jedoch nicht nach Therapiebeginn.
The aim of this study was to evaluate the role and clinical benefit of extracellular vesicles (EV) in pediatric acute myeloid leukemia (AML). For this purpose, 166 plasma samples from 45 patients with known AML from the Biobank of the Children's Hospital III of the University Hospital Essen were used to extract and analyse the extracellular vesicles contained therein to establish an alternative detection method for AML-specific mutations. The collected plasma samples were each taken at the time of diagnosis and for further follow-up. Preliminary cell-level experiments were performed using two classical AML cell lines. After cultivation, the extracellular vesicles were obtained by ultracentrifugation. Subsequently, RNA was extracted from these and analysed for possible mutations using RealTime PCR or GeneScan-based fragment length analysis. There, signals in the assays were only observed in the cell line positive for the mutation. Subsequently, the extracellular vesicles of the patient samples were also obtained. From the EVs of a total of 29 selected patients, either the DNA and / or the RNA was now obtained and quantified. RNA analysis of the mutations revealed that the NPM1 mutation was found in seven patients at the time of diagnosis, whereas this was not possible in two patient samples. In the patient samples with FLT3-ITD mutation, it was possible to detect the mutation in all initial samples. However, the initial mutations were no longer detectable in the samples after treatment initiation which was not always in correlation with the results of routine genomic DNA analysis performed in our diagnostic AML laboratory. An additional 16 patients were evaluated for their EV DNA mutations by gene scan-based fragment length analysis. Also, in this assay, the mutations already found in the gDNA showed up in the EV DNA of the initial samples. Only in one sample, no mutation was detectable. In four of the 16 samples measured, it was also possible to detect the corresponding mutation in a follow-up sample. In summary, we succeeded in finding the mutation in EV RNA and EV DNA in almost all samples at the time of diagnosis, but not in the follow-up controls after the start of therapy.