Synthesis, characterisation and in vitro investigation of bioactive nanoparticles

In the first part of this work calcium phosphate nanoparticles were synthesized and functionalized with different nucleic acids and dyes to be appropriate for tracking in cells. Strategies for the transport of the synthesized nanoparticles into the intestine were developed with gelatin soft capsules and suppositories. If the nanoparticles are to reach the intestine via oral intake, they must be protected from gastric acid. For this purpose, freeze-dried nanoparticles were filled into a gelatin capsule and coated with different enteric polymers such as Eudragit L 100, a combination of Eudragit L 100 and chitosan, CAP, HPMC-Eudragit L 100, and HPMC-PVA-Eudragit L 100. Different enteric coatings were developed to make the release of nanoparticles more site and time specific. The Protection of the nanoparticles in enteric coated gelatin capsules against gastric acid was researched in simulation experiments. The time specific release rate of the nanoparticles in acidic medium simulating the gastric environment and in basic medium simulating the intestine environment was tracked by AAS and UV/Vis. All the polymer coated capsules showed proper protection of the nanoparticles in acidic medium. The Release rate of the nanoparticles varied for the different enteric coating systems. Eudragit L 100 coated capsule showed delayed release in comparison to the other coated capsules. Nevertheless, if a capsule is coated with a combination of Eudragit L 100 and chitosan, the release rate increases drastically. Another capsule coating system benefits of two layers of polymers. The first layer is a water-soluble polymer and the second layer acts as a protective layer like Eudragit L 100.  HPMC-Eudragit L 100 and HPMC-PVA-Eudragit L 100 coated gelatin capsules showed faster release rate than only Eudragit L 100 coated capsule and slower release rate than the Eudragit L 100-chitosan coated capsules.  

The released nanoparticles from the capsule were studied in in vitro by MTT test, uptake, and transfection in HeLa and Caco-2 cell lines. Cell viability of nanoparticles released from Eudragit L 100 coated capsules and Eudragit® L 100-chitosan coated capsules showed around 40 % viability by both HeLa and Caco-2 cells indicating improper interaction between Eudragit L 100, soft gelatin capsule and nanoparticles. The polymer layer protected the nanoparticles from degradation in gastric acid, but after dissolution at neutral pH values, the polymer interacted with the positively charged nanoparticles, so that they were no longer functional in the cell culture. Uptake and transfection studies also showed that the released nanoparticles from Eudragit L 100 coated capsule and Eudragit L 100-chitosan coated capsule were not appropriate in cell studies. Other coated capsules showed suitable cell viability around 85 % in both HeLa and Caco-2 cells. The released nanoparticles from CAP, HPMC-Eudragit L 100, and HPMC-PVA-Eudragit L 100 coated capsules could easily be taken up and transfected by both cell lines. Gene silencing was studied by using HeLa-EGFP cells. All released nanoparticles except for the particles released from Eudragit L 100 and Eudragit L 100-chitosan coated capsules showed high gene silencing efficiency which proved functionality of the particles after the release. Alternatively, a suppository was developed that could release the nanoparticles in the intestine after rectal application. In in vitro tests it was found that the particles, after being released from a suppository, had very suitable cell viability, cell uptake and transfection efficiency as well as muting efficiencies.  

In the second part of this work Ultra-small gold nanoparticles (about 1.8 nm) and nanoclusters were synthesized, characterized and studied in vitro. Nanoparticles and nanoclusters showed very well cell uptake and viability by HeLa cells. These nanoparticles and nanoclusters then were filled in the previously developed capsules and suppositories. Ultra-small gold nanoclusters were coated with dyed BSA and the nanoparticles functionalized with a FITC dye to be pursuable in in vitro studies. Gold nanoparticles and nanoclusters released from coated capsules showed impeccable cell viability and cell uptake by HeLa cells. BSA-dye coated nanoclusters proved that the gold nanoclusters were able to carry BSA in the HeLa cells.

In the next part of this present work, the use of composite materials made of calcium phosphate and biodegradable polymers based on polylactide for the transport of active substances was investigated. Calcium phosphate PLGA nanoparticles were developed as an active substance carrier system for anionic, hydrophilic active substances such as nucleic acids. Water-in-oil-in-water emulsion techniques proved to be optimal synthesis routes and delivered spherical calcium phosphate PLGA nanoparticles with a core diameter of approx. 100 nm.  Cell uptake and transfection studies using confocal laser scanning microscopy showed that the nanoparticles were absorbed and transfected very well by HeLa cells. Gene silencing studies with the nanoparticles showed also that these nanoparticles had ideal muting efficiency by HeLa-EGFP cells. 

In the last part of this work, strontium- and magnesium-doped calcium phosphate nanoparticles were synthesized for bone regeneration properties. These nanoparticles were doped with concentrations of 5 %, 10 %, 15 %, and 20 % strontium and magnesium, respectively. These nanoparticles were characterized and studied in vitro. Spherical nanoparticles with comparable sizes at about 50-70 nm for all compositions were achieved. Cell viability and cell uptake of the nanoparticles were studied with HeLa, MG-63, and MC3T3 cell lines. All the strontium and magnesium doped calcium phosphate nanoparticles showed promising cell viability by more than 70 % and very proper uptake by these three different cell lines. These doped nanoparticles showed very slight variances in comparison to each other, and a better uptake compared to pure calcium phosphate nanoparticles. In this work, the effect of both strontium- and magnesium-doped calcium phosphate nanoparticles on the production of alkaline phosphatase by HeLa cells after 7, 14, and 21 days of culture were shown. After culturing for 7 days, the relative ALP activities of HeLa cells were higher on the sample groups treated with nanoparticles as compared with controls. After 14, and 21 days, the relative ALP activities of HeLa cells were three times and four times higher on the sample groups treated with nanoparticles as compared with controls.

In summary, it can be stated that in the present work materials and particles based on calcium phosphate were successfully developed both for the transport of active substances in nanomedicine and for the generative production of bone substitute materials. 

Im ersten Teil dieser Arbeit wurden Calciumphosphat-Nanopartikel synthetisiert und mit verschiedenen Nukleinsäuren und Farbstoffen funktionalisiert, um sie für das Tracking in Zellen geeignet zu machen. Strategien für den Transport der synthetisierten Nanopartikel in den Darm wurden mit Gelatine-Weichkapseln und Zäpfchen entwickelt. Sollen die Nanopartikel über die orale Aufnahme in den Darm gelangen, müssen sie vor der Magensäure geschützt werden. Dazu wurden gefriergetrocknete Nanopartikel in eine Weichkapsel gefüllt und mit verschiedenen magensaftresistenten Polymeren wie Eudragit L 100, einer Kombination aus Eudragit L 100 und Chitosan, CAP, HPMC-Eudragit L 100 und HPMC-PVA beschichtet -Eudragit L 100. Verschiedene magensaftresistente Beschichtungen wurden entwickelt, um die Freisetzung von Nanopartikeln orts- und zeitspezifisch zu gestalten. Der Schutz der Nanopartikel in magensaftresistenten Weichkapseln gegen Magensäure wurde in Simulationsexperimenten untersucht. Die zeitspezifische Freisetzungsrate der Nanopartikel in saurem Medium, das die Magenumgebung simuliert, und in basischem Medium, das die Darmumgebung simuliert, wurde mit AAS und UV-Vis verfolgt. Alle mit Polymer beschichteten Kapseln zeigten einen angemessenen Schutz der Nanopartikel in saurem Medium, wobei die Freisetzungsrate der Nanopartikel für die verschiedenen magensaftresistenten Beschichtungssysteme variierte. Die mit Eudragit L 100 beschichtete Kapsel zeigte im Vergleich zu den anderen beschichteten Kapseln eine verzögerte Freisetzung. Wird eine Kapsel dennoch mit einer Kombination aus Eudragit® L 100 und Chitosan beschichtet, erhöht sich die Freisetzungsrate drastisch. Ein weiteres Kapselbeschichtungssystem profitiert von zwei Polymerschichten. Die erste Schicht ist ein wasserlösliches Polymer und die zweite Schicht fungiert als Schutzschicht. Die Eudragit L 100. HPMC-Eudragit L 100 und HPMC-PVA-Eudragit L 100 beschichteten Kapseln zeigten eine schnellere Freisetzungsrate als nur Eudragit L 100-beschichtete Kapseln und eine langsamere Freisetzungsrate als die Eudragit L 100-Chitosan-beschichteten Kapseln. Die freigesetzten Nanopartikel aus der Kapsel wurden in vitro durch MTT-Test, Zell-Aufnahme und Transfektion in HeLa- und Caco-2-Zelllinien untersucht. Die Zellviabilität von HeLa und Caco-2-Zellen zeigte für Nanopartikel, die aus Eudragit L 100- und Eudragit L 100-Chitosan-beschichteten Kapseln freigesetzt wurden, Werte von etwa 40 %, was auf eine schädliche Wechselwirkung zwischen Eudragit L 100, Weichgelatinekapsel und Nanopartikeln hindeutet. Die Polymerschicht schützte die Nanopartikel vor der Auflösung in der Magensäure, aber nach Auflösung bei neutralen pH-Werten wechselwirkte das Polymer mit den positiv geladenen Nanopartikeln, so dass diese in der Zellkultur nicht mehr funktionsfähig waren. Aufnahme- und Transfektionsstudien zeigten auch, dass die freigesetzten Nanopartikel aus Eudragit L 100-beschichteten Kapseln und Eudragit L 100-Chitosan-beschichteten Kapseln für Zellstudien nicht geeignet waren. Andere beschichtete Kapseln zeigten eine geeignete Zellviabilität von etwa 85 % sowohl in den HeLa- als auch in den Caco-2-Zellen. Die freigesetzten Nanopartikel aus CAP, HPMC-Eudragit L 100 und HPMC-PVA-Eudragit L 100 beschichteten Kapseln konnten problemlos von beiden Zelllinien aufgenommen und transfiziert werden. Gen-Stummschaltung wurde durch die Verwendung von HeLa-EGFP-Zellen untersucht. Alle freigesetzten Nanopartikel mit Ausnahme der Partikel, die von Eudragit L 100 und Eudragit L 100-Chitosan-beschichteten Kapseln freigesetzt wurden, zeigten eine hohe Gen-Stummschaltungs-Effizienz, was die Funktionalität der Partikel nach der Freisetzung bewies. Alternativ wurde ein Zäpfchen entwickelt, das die Nanopartikel nach rektaler Applikation im Darm freisetzen könnte. In In-vitro-Tests wurde festgestellt, dass die Partikel, nachdem sie aus einem Zäpfchen freigesetzt wurden, eine sehr geeignete Zellviabilität, Zellaufnahme- und Transfektionseffizienz sowie Stummschaltungs-Effizienz aufwiesen. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden ultrakleine Goldnanopartikel (ca. 1,8 nm) und Nanocluster synthetisiert, charakterisiert und in vitro untersucht. Nanopartikel und Nanocluster zeigten eine sehr gute Zellaufnahme und Viabilität bei HeLa-Zellen. Diese Nanopartikel und Nanocluster wurden dann in die zuvor entwickelten Kapseln und Zäpfchen gefüllt. Ultrakleine Goldnanocluster wurden mit gelabeltem BSA beschichtet und die Nanopartikel mit einem FITC-Farbstoff funktionalisiert, um in in-vitro-Studien verfolgt werden zu können. Aus beschichteten Kapseln freigesetzte Goldnanopartikel und Nanocluster zeigten eine einwandfreie Zellviabilität und Zellaufnahme durch HeLa-Zellen. BSA-farbstoffbeschichtete Nanocluster bewiesen, dass die Gold-Nanocluster BSA in die HeLa-Zellen tragen können.

Im nächsten Teil der vorliegenden Arbeit wurde der Einsatz von Verbundmaterialien aus Calciumphosphat und biologisch abbaubaren Polymeren auf Basis von Polylactid für den Wirkstofftransport untersucht. Als Wirkstoffträgersystem für anionische, hydrophile Wirkstoffe wie Nukleinsäuren wurden Calciumphosphat-PLGA-Nanopartikel entwickelt. Wasser-in-Öl-in-Wasser-Emulsionstechniken erwiesen sich als optimale Syntheserouten und lieferten sphärische Calciumphosphat-PLGA-Nanopartikel mit einem Kerndurchmesser von ca. 100 nm. Zellaufnahme- und Transfektionsstudien mit konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie zeigten, dass die Nanopartikel sehr gut von HeLa-Zellen absorbiert und transfiziert wurden. Gen-Stummschaltungs-Studien mit den Nanopartikeln zeigten auch, dass diese Nanopartikel eine ideale Stummschaltungseffizienz-Effizienz bei HeLa-EGFP-Zellen aufweisen. Im letzten Teil dieser Arbeit wurden Strontium- und Magnesium-dotierte Calciumphosphat-Nanopartikel für Knochenregenerationseigenschaften synthetisiert. Diese Nanopartikel wurden mit Konzentrationen von 5 %, 10 %, 15 % bzw. 20 % Strontium und Magnesium dotiert. Diese Nanopartikel wurden in-vitro charakterisiert und untersucht. Es wurden sphärische Nanopartikel mit vergleichbaren Größen bei etwa 50-70 nm für alle Zusammensetzungen erzielt. Die Viabilität der Zellen und die Zellaufnahme der Nanopartikel wurden mit HeLa-, MG-63- und MC3T3-Zelllinien untersucht. Alle mit Strontium und Magnesium dotierten Calciumphosphat-Nanopartikel zeigten eine vielversprechende Zellviabilität von mehr als 70 % und eine sehr gute Aufnahme durch diese drei verschiedenen Zelllinien. Diese dotierten Nanopartikel zeigten im Vergleich zueinander sehr geringe Abweichungen und eine bessere Aufnahme im Vergleich zu reinen Calciumphosphat-Nanopartikeln. In dieser Arbeit wurde die Wirkung von sowohl Strontium- als auch Magnesium-dotierten Calciumphosphat-Nanopartikeln auf die Produktion von alkalischer Phosphatase durch HeLa-Zellen nach 7, 14 und 21 Tagen Kultivierung gezeigt. Nach 7-tägiger Kultivierung waren die relativen ALP-Aktivitäten der HeLa-Zellen bei den mit Nanopartikeln behandelten Probengruppen im Vergleich zu den Kontrollen höher. Nach 14 und 21 Tagen waren die relativen ALP-Aktivitäten der HeLa-Zellen bei den mit Nanopartikeln behandelten Probengruppen im Vergleich zu den Kontrollen dreimal beziehungsweise viermal höher. Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass in der vorliegenden Arbeit sowohl für den Wirkstofftransport in der Nanomedizin als auch für die generative Herstellung von Knochenersatzmaterialien erfolgreich Materialien und Partikel auf Basis von Calciumphosphat entwickelt wurden.


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