Peptide-conjugated fluorophores with aggregation-induced emission properties for specific protein recognition
The phenomenon of aggregation-induced emission (AIE) has become increasingly popular in recent years and a wide range of fluorophores exhibiting AIE properties (AIEgens) were synthesized for the specific recognition of small biogenic molecules
and biological macromolecules [109, 161]. Upon protein binding the molecular motions of the fluorophores are restricted, which induces an increase in fluorescence signal, which can be used as a direct read-out option for binding analysis. However, the AIEgens were only used for qualitative recognition. In contrast, the new fluorophores in this work were used for quantitative analysis of protein binding using fluorescence.
This new and unique class of luminophores is based on aromatic thioethers bearing nitrile groups in ortho-position and were successfully modified with peptides for the specific recognition of the hPin1-WW domain. Therefore, peptides containing the hPin1 specific pThr-Pro binding motif were synthesized by solid phase peptide synthesis (SPPS) and coupled to the AIE-core by copper(I)-catalyzed alkine-azide cycloaddition (CuAAC). hPin1 is a well described protein and the WW-domain, known as the substrate binding module, was used as a model protein to build a fluorescence-based assay for protein binding with direct read-out from fluorescence intensity.
Biochemical characterization of the new fluorophores showed an increased solubility in aqueous solutions and enhanced salt tolerance compared to previously described thioterephthalonitrile (TPN) derivatives [97]. Dissolved in an aqueous solution, the fluorophores exhibited low autofluorescence induced by the fluorophore structure, showing the peptide being helically twisted over the AIE-core and bound on top of the aromatic rings. Upon protein binding the fluorescence signal increased significantly and proves the excellent aggregation-induced emission enhancement (AIEE) properties of the fluorophores. Specificity against the hPin1-WW domain was demonstrated by both NMR and fluorescence titration experiments and all fluorophores exhibited good binding constants in a low μM range.
By adding amino acids between the aromatic AIE-core and the hPin1 specific pThr-Pro binding motif, the influence of a linker and its length was investigated. At low fluorophore concentrations (≤ 25 μM) the protein binding was similar for all linker lengths, but at higher fluorophore concentrations (≥ 25 μM) the binding curves could not be fitted with the expected binding model of two proteins binding a single fluorophore molecule. The effect was enhanced at greater linker lengths and was also increased at higher fluorophore concentrations, making the AIEgen suitable for protein detection and binding analysis only at low concentrations.
Finally, the NMR structure of a fluorophore bearing a single peptide-arm was solved alone and in complex with the hPin1-WW domain and showed the fluorophore-protein interaction and rotational restrictions at a structural level. The hPin1-WW domain exhibited the typical three-stranded antiparallel β-sheet with the fluorophore bound on top. The coupled peptide is recognized first and the aromatic AIE-core makes additional contacts with the WW-domain.
In summary, the specific protein recognition and the quantitative analysis of protein binding was demonstrated for peptide-coupled TPN fluorophores in a fluorescence based assay with direct read-out. In addition, the binding was shown by the protein-fluorophore complex structure.
Das Phänomen der aggregationsinduzierten Emission (AIE) ist in den letzten Jahren immer beliebter geworden und viele Fluorophore mit AIE-Eigenschaften (AIEgens) wurden für die spezifische Erkennung von kleinen biogenen Molekülen und biologischen Makromolekülen synthetisiert [109, 161]. Allerdings wurden diese nur für den qualitativen Nachweis verwendet. Im Gegensatz dazu wurden die neuen Fluorophore in dieser Arbeit für die quantitative Untersuchung von Protein-Ligand-Bindungen verwendet.
Diese neue Klasse an Luminophoren basiert auf aromatischen Thioethern mit zusätzlichen Nitrilgruppen in ortho-Position und wurde hier erfolgreich für die spezifische Erkennung der hPin1-WW-Domäne modifiziert. Dazu wurden Peptide mit dem hPin1-spezifischen pThr-Pro-Bindungsmotiv durch Festphasen-Peptidsynthese (SPPS) hergestellt und mit Hilfe der Kupfer(I)-katalysierten Alkin-Azid-Cycloaddition (CuAAC) an den aromatischen AIE-Kern gekoppelt. hPin1 ist ein hervorragend untersuchtes Protein und die WW-Domäne, beschrieben als das Substratbindungsmodul, wurde deshalb als Modellprotein für einen fluoreszenzbasierten Assay verwendet. Die Protein-Ligand Bindung kann durch die AIEgens direkt über die Fluoreszenzintensität verfolgt und ausgelesen werden.
Die biochemische Charakterisierung der neuen AIEgens zeigte eine erhöhte Löslichkeit in wässrigen Lösungen und eine deutlich verbesserte Salztoleranz im Vergleich zu den bisher beschriebenen Thioterephthalonitril (TPN)-Derivaten [97]. Die AIEgens wiesen zudem eine geringe Autofluoreszenz auf, die durch die Struktur des Fluorophors erklärt werden kann. Der Fluorophor bildet einen C-förmigen aromatischen AIE-Kern mit dem Peptid helikal nach oben gedreht und auf den aromatischen Ringen gebunden. Durch Proteinbindung nimmt die induzierte Fluoreszenz deutlich zu und beweist so die hervorragenden aggregationsinduzierten emissionsverstärkenden (AIEE)-Eigenschaften. Die Spezifität für die hPin1-WW-Domäne wurde sowohl durch NMR als auch durch Fluoreszenz-Titrationsexperimente nachgewiesen und ergab gute Bindungskonstanten in einem niedrigen μM-Bereich für alle Fluorophore.
Durch das Einfügen von Aminosäuren zwischen den aromatischen AIE-Kern und dem pThr-Pro-Bindungsmotiv wurde der Einfluss eines Linkers und dessen Länge untersucht. Bei niedriger Fluorophorkonzentration (≤ 25 μM) konnten keine Unterschiede in der Proteinbindung der Fluorophore in Abhängigkeit der Linkerlänge festgestellt werden. Bei höheren Fluorophorkonzentrationen (≥ 25 μM) jedoch konnten die Bindungskurven nicht mit dem erwarteten Bindungsmodell (2 Proteine : 1 Fluorophor) analysiert werden. Dieser Effekt verstärkt sich mit höheren Fluorophorkonzentrationen und ist bei größeren Linkern ausgeprägter, weshalb die AIEgens nur bei niedrigen Konzentrationen verwendet werden können.
Abschließend wurde die NMR-Struktur eines Fluorophors im Komplex mit der hPin1-WW-Domäne gelöst. Die Komplexstruktur besteht aus dem bekannten dreisträngigen antiparallelen β-Faltblatt der WW-Domäne und dem oberhalb gebundenen Fluorophor. Das gekoppelte Peptid wird dabei von der WW-Domäne spezifisch erkannt. Durch die zusätzlichen Kontakte der WW-Domäne zum aromatischen AIE-Kern können die Rotationsbeschränkungen des Fluorophors sichtbar gemacht werden.
Somit wurde die spezifische Proteinerkennung und die quantitative Analyse der Proteinbindung für peptidgekoppelte TPN-Fluorophore in einem fluoreszenzbasierten Assay mit direktem read-out nachgewiesen und die Bindung anhand der Struktur des Protein-Fluorophor-Komplexes veranschaulicht.