Characterization and validation of radiation relevant normal tissue factors without tumor promoting features
Radiotherapy (RT) is used in approximately every second cancer patient, both for curative and palliative purposes. Even though RT was improved over the years, to prevent from normal tissue toxicity, patients still suffer from adverse effects. Within thoracic irradiation, life‑threatening early and late toxicities (RT‑induced pneumonitis and fibrosis, respectively) act dose‑limiting, precluding the application of curative radiation doses. Hence, current pharmaceutical modulations aim to widen the therapeutical window, by achieving radioprotection of normal lung tissue, ideally without tumor promoting or preferentially with tumor radiosensitizing effects.
Cellular senescence in lung epithelial cells and the altered senescence‑associated secretory phenotype (SASP) were suggested as central processes in acute and late lung toxicities, following RT‑induced cellular stress. Herein, abrogation of certain aspects of the senescent secretome, particularly signaling inhibition of the SASP-factor Ccl2/ Mcp1, mediated radioprotection of normal lung tissue, especially concerning the lung vascular system. Previously, our group reported that Ccl2 inhibition resulted in limited endothelial dysfunction.
Within the present thesis, the therapeutic potential of a combined metformin treatment to protect normal lung tissue from RT-induced senescence and associated lung injury was investigated. Therefore, a preclinical model of radiation‑induced pneumopathy were used and complementary in vitro investigations were performed. Metformin treatment efficiently limited RT‑induced senescence of (bronchial) epithelial cells within lungs and SASP expression levels. Thereby vascular dysfunctions were limited, namely increased vascular permeability associated with increased extravasation of circulating immune and tumor cells, early after irradiation (acute effects).
Respective in vitro experiments were performed in three normal (BEAS‑2B, HSAEC1‑KT, HBEC‑3KT) and two malignant (NCI‑H460, A549) lung epithelial cells. Cell death levels of normal lung epithelial cells were not affected by metformin treatment and even respective clonogenic survivals were not impaired. At the same time, metformin limited RT-induced senescence in normal epithelial cells, an effect that coincided with reduced RT-induced ROS levels upon metformin treatment. Compared to normal epithelial cells, both NSCLC cells revealed higher mitochondrial respiration and glycolysis rates, depicting enhanced metabolisms to address higher energy demands, resulting from increased proliferation, migration as well as invasion capacities. RT-induced ROS levels in malignant epithelial cells were further increased upon combined metformin treatment, accompanied by higher cell death levels, and reduced clonogenic survival. Consequently, both cell fates, apoptosis, and senescence, following RT‑induced oxidative stress were shown to rely on the (cellular) proliferation state.
Taken together, normal epithelial cells confirmed the senescence-limiting effect of metformin following RT, finally resulting in radioprotection, while fostering RT-induced cellular stress of cultured malignant epithelial cells accounting for radiosensitization. The combined treatment reduced the metabolic potential of both malignant epithelial cell types, which mainly rely on oxidative phosphorylation and less on glycolysis. Thus, metformin is beneficial to prevent from RT‑induced damages in normal lungs. Particularly, RT-induced senescence could be prevented by metformin treatment, mediating radioprotection, especially of the vascular compartment without simultaneous protection of respective cancer tissues and rather radiosensitizing the latter one.
Further, head and neck squamous cell carcinoma cells with a differential radiation response (acquired radiosensitivity (Cal33 #303) and radioresistance (Cal33 #327)) were analyzed. Here, the more radioresistant cells (Cal33 #327) could be sensitized by a combined treatment of metformin and RT. Furthermore, these cells displayed a reduced metabolic potential as well as an increased cellular stress level upon combined RT and metformin treatment.
Conclusively, this thesis provides new insights in the differential metformin treatment outcomes of normal tissue versus tumor tissue. Cancer cells were more sensitive to starvation‑induced cytotoxicity and metabolic oxidative stress than non‑transformed cells. Therefore, metformin treatment is strongly suggested as a potential agent for combined cancer therapy increasing the therapeutic window. The radioprotective action of metformin for normal lung tissue without simultaneous protection or preferable radiosensitization of tumor tissue might increase tumor control probabilities and survival as higher radiation doses could be used.
Jeder zweite Krebspatient durchläuft im Laufe seiner Therapie eine Strahlenbehandlung. Hierbei zielt die Strahlentherapie darauf ab, die Tumorlast zu reduzieren oder auch die Tumore zu eliminieren, wobei das umgebende Normalgewebe möglichst von Langzeitschäden verschont bleiben soll. Unter Verwendung kurativer Strahlendosen geht eine erfolgreiche Behandlung maligner Tumore jedoch meist mit einer Schädigung des umliegenden, gesunden Normalgewebes einher. Im strahlensensitiven Lungengewebe kann es zu schwerwiegenden Langzeitschäden, genauer gesagt zu Pneumopathie und Fibrose, kommen. Um eine verbesserte Symptomkontrolle und Lebensqualität für die Patienten zu erreichen, zielen derzeitige Forschungsanstrengungen darauf ab, die Strahlensensitivität des Normalgewebes pharmakologisch herabzusetzen, ohne jedoch das Tumorwachstum zu fördern.
Als ein zentraler Signalweg innerhalb der strahleninduzierten Normalgewebstoxizität konnte bereits die Seneszenz identifiziert werden. Im Zuge von Thorax-assoziierten Bestrahlungen hat sich gezeigt, dass vorwiegend die bronchoalveolären Epithelzellen seneszent werden. Eine potenzielle Behandlungsmethode zur Normalgewebsprotektion könnte daher die gezielte Modulation des Seneszenz-assoziierten sekretorischen Phänotyps (SASP) sein, d.h. eine Signalinhibierung von bestimmten Seneszenz-assoziierten Zytokinen und Wachstumsfaktoren, die entscheidend bei der Lungenschädigung involviert sind. So konnte innerhalb der eigenen Arbeitsgruppe bereits gezeigt werden, dass eine Inhibition des SASP-Faktors CC-Chemokine Ligand 2 (Ccl2), auch bekannt als Monocyte Chemotactic Protein 1 (MCP-1) mit einer Radioprotektion des Lungengewebes einhergeht, insbesondere in Bezug auf das vaskuläre System.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es nun, den Einfluss eines potenziellen Seneszenz-modulierenden Medikaments, des Metformins, bei der strahleninduzierten Seneszenz von Lungengewebe zu eruieren. Mit hilfe eines präklinischen Mausmodels (der strahlungsinduzierten Pneumopathie) konnte gezeigt werden, dass die gleichzeitige Gabe von Metformin im Zuge einer Lungenbestrahlung eine Minimierung der Seneszenz bewirkte, welche mit einer Limitierung von vaskulären Schäden einherging, wodurch Entzündungsprozesse und Metastasen-Bildung günstig beeinflusst werden konnten. Die erzielten Resultate wurden durch entsprechende in vitro Experimente bestätigt und weiter spezifiziert. Hierzu wurden drei Lungen- Normalgewebszelllinien (BEAS‑2B, HSAEC1‑KT und HBEC‑3KT) und zwei maligne Lungenzelllinien (NCI‑H460 und A549) verwendet. Eine Metformin‑Behandlung konnte hier ebenso die strahleninduzierte Seneszenz vermindern. Zudem wurden weitere Einblicke in den zugrunde liegenden Mechanismus gewonnen. In Kombination mit Bestrahlung führte Metformin in Normalgewebszellen zu einer signifikanten Inhibition der (mitochondriellen) Zellatmung und damit einhergehend zu reduzierten ATP‑Levels. Ein negativer Behandlungseinfluss bzgl. Zelltodinduktion oder Langzeitüberleben konnte jedoch ausgeschlossen werden. In malignen Epithelzellen, die sich durch eine stark erhöhte mitochondrielle Atmung, sowie Glykolyse als zentrale Energiequellen auszeichnen, führte die kombinierte Metformin-Behandlung hingegen zu vermehrtem zellulären Stress, welcher letztendlich den Zelltod induzierte sowie das klonogene Überleben deutlich herabsetzte.
Abschließend konnten die Ergebnisse, die dieser Arbeit zugrunde liegen, zeigen, dass Metformin die strahleninduzierte Seneszenz limitiert und das normale Lungengewebe vor Strahlenschäden schützen kann. Hierbei konnte insbesondere eine Radioprotektion des vaskulären Systems beobachtet werden. Zudem konnten in vitro Studien keinen negativen Einfluss von Metformin auf Normalgewebszellen aufzeigen. Es konnten insbesondere jedoch Tumorzellen durch Metformin zunehmend geschädigt werden. Diese Ergebnisse betonen, dass eine kombinierte Gabe von Metformin im Zuge einer Strahlentherapie zur Modulation der Strahlenwirkung ein sehr großes Potential besitzt, da das Normalgewebe vor akuten Strahlenschäden geschützt werden kann, ohne dass das Tumorwachstum gefördert wird.