Charakterisierung humaner intestinaler epithelialer Organoide bei chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen (CED) oder kolorektalem Karzinom (KRK)

Sowohl bei chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen (CED) als auch bei Kolorektalen Karzinomen (KRK) sind morphologische und funktionale Veränderungen des intestinalen Epithels nachweisbar, die pathogenetisch bisher jedoch nicht vollständig geklärt sind. Bisherige 2D-in-vitro-Kulturen humaner intestinaler Epithelzellen (IEC) spiegeln die komplexe in-vivo-Situation nur eingeschränkt wider. Das kürzlich etablierte Organoidmodell ermöglicht die erfolgreiche Kultivierung primärer IEC von individuellen Patienten in in-vivo-ähnlicher 3D-Zellstruktur. Aufgrund mangelnder Standardisierung der Organoid-Kulturprotokolle sind die Ergebnisse verschiedener Arbeitsgruppen derzeit jedoch kaum untereinander vergleichbar.

Ziel dieser Arbeit war im ersten Schritt die Etablierung eines standardisierten Kulturprotokolls für intestinale epitheliale 3D-Organoide, um im zweiten Schritt epithelspezifische Unterschiede zwischen Kontroll- und CED- bzw. KRK-Organoidlinien (OL) molekular- und zellbiologisch zu charakterisieren.

Im ersten Teil dieser Arbeit wurden Kulturdauer, Zeitpunkt des Mediumwechsels, Zelldichte und Passagenzahl für die standardisierte Organoidkultur optimiert, um übermäßige Differenzierung und Apoptose zu vermeiden.

Im zweiten Teil der Arbeit konnten in Colitis ulcerosa (CU)- und KRK-Organoiden inflammatorische bzw. tumorspezifische Modifikationen nachgewiesen werden. Im Vergleich zu ‚gesunden‘ Kontroll-OL war der Becherzell-Anteil in CU-OL signifikant reduziert und konnte weder durch gezielte Ausdifferenzierung noch durch bakterielle oder proinflammatorische Stimulationen erhöht werden. CU-Organoide zeigten einen erhöhten Anteil an zellulärer DNA-Schädigung und bildeten bei Langzeitkultur vermehrt Sphäroide, bestehend aus einem abgeflachten, undifferenzierten Epithel-Monolayer. Diese Beobachtungen deuteten auf eine endogene Differenzierungsstörung der intestinalen Stammzellen bei CU hin. Des Weiteren wiesen CU-Organoide funktional eine erhöhte Barriere-Permeabilität und eine reduzierte antimikrobielle Abwehr auf. Die Ergebnisse der spezifischen TLR2-Stimulation mittels Pam3Cys-SK4 legen nahe, dass der Barriere-protektive Effekt in CU-OL aufgrund einer TLR2-Dysfunktion signifikant eingeschränkt war.

In KRK-OL wurden tumorcharakteristisch geringe Differenzierungsgrade, Verluste der regelrechten Kryptenstruktur und invasives Wachstum nachgewiesen. Die individuellen Expressionsprofile der mit Multi-Drug-Resistenz assoziierten ABC-Transportergene blieben ex-vivo homolog zur in-vivo-Expression erhalten. Die patientenindividuelle Chemosensitivität der einzelnen KRK-OL gegenüber Paclitaxel ließ sich jedoch nicht eindeutig auf Modulationen des Expressionsprofils zentraler ABC-Transporter zurückführen. In einem ‘proof-of-principle‘-Ansatz konnte gezeigt werden, dass Probiotika (am Beispiel von lebenden und hitzeinaktivierten Lactobacillus rhamnosus GG) die Anti-Tumor-Wirkung von Chemotherapeutika patientenindividuell sowohl verstärken als auch abschwächen können.

Zusammenfassend ist die standardisierte Organoidkultur ein vielversprechendes epitheliales 3D-Modell, in dem die krankheitsspezifischen Charakteristika von CU und KRK patientenindividuell erhalten bleiben und im Detail analysiert werden können. Die Heterogenität der Erkrankungen spiegelte sich in den untersuchten Organoid-Kollektiven wider. Zukünftig könnten humane intestinale Organoidkulturen in der personalisierten Medizin und bei der Therapie-Entwicklung eingesetzt werden. Um die komplexe in-vivo-Situation zukünftig besser modellieren zu können, sollte das ex-vivo-Organoidmodell jedoch in Hinblick auf Immunzell- und Mikrobiom-Interaktionen weiterentwickelt werden.

In inflammatory bowel disease (IBD) as well as colorectal carcinoma (CRC), the intestinal epithelium exhibits morphological and functional changes, which are not yet fully understood. Previously used 2D in vitroIEC-lines and mouse models do not adequately represent the complex human in vivo situation. The recently established organoid model allows for successful cultivation of primary intestinal epithelial cells (IEC) of individual patients in in-vivo-like 3D-structures. However, due to the high variation of culture protocols results of various research groups are not sufficiently comparable.

The aim of the study was to establish standardized culture protocols of intestinal 3D organoids in order to characterize epithelial-specific differences between control and IBD or CRC organoid lines (OL).

First, various parameters of ‘healthy’ organoid culture, such as duration, time of media exchange, cell density and passage number, were optimized and standardized in order to avoid excessive differentiation and apoptosis.

Second, inflammatory- and tumor-specific modifications were assessed in ulcerative colitis (UC) and CRC organoids. Compared to 'healthy' control-OL, the goblet cell proportion in UC-OL was significantly reduced and could not be increased by forced differentiation or bacterial/inflammatory stimulation. UC-OL showed increased cellular DNA damage and formed more spheroids in long-term culture, which consisted of a flattened, undifferentiated epithelial monolayer, implying an endogenous dysfunction of differentiation in UC-IEC. Functionally, UC-organoids showed increased barrier permeability and reduced antimicrobial defense. Stimulation with TLR2-ligand Pam3Cys-SK4 demonstrated impaired barrier integrity, possibly due to a TLR2 dysfunction in UC-OL.

CRC-OL showed low differentiation, crypt loss and invasive growth. The individual gene expression profiles of ABC transporters associated with multi-drug resistance were maintained in CRC-OL ex vivo. However, chemosensitivity of CRC-OLs to paclitaxel did not correlate with modulation of central ABC transporter gene expressions. In a ‘proof-of-principle’ approach, treatment with probiotics (living and heat-inactivated Lactobacillus rhamnosus GG) increased or decreased the anti-tumor effect of chemotherapeutic agents in a patient-dependent manner.

In summary, when standardized, organoid culture represents a promising epithelial 3D-model which reflects disease specific characteristics of UC and CRC for each patient. The interindividual pathophysiological heterogeneity of the diseases was maintained in the individual OL. In future studies, human intestinal organoid cultures could be used to develop novel therapeutic approaches in personalized medicine. To model the complex in vivo situation more appropriately, immune cell and microbiome interactions must be included in a more sophisticated ex vivo organoid model.

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