The role of Par17’s N-terminus in interaction and function of the enzyme
Peptidyl-Prolyl cis/trans isomerases (PPIases) are important enzymes which accelerate protein folding and regulate proteins participating in various cellular processes. The group of parvulin-like PPIases includes the two human isoforms parvulin 14 (Par14) and parvulin 17 (Par17), which originate from the same gene (PIN4) by alternative transcription initiation. Both proteins share the same PPIase domain and N-terminus, and Par17 additionally carries an N-terminal extension of 25 amino acids. Despite this small difference, the two parvulins occur in different cellular compartments, which suggests that the proteins have different functions. Research conducted so far has rarely differentiated between both isoforms, although these parvulins are found in cancer related processes and play a role in virus replication.
This work now studies the influence of the additional 25 N-terminal amino acids of Par17 on the function and interaction of the enzyme. First, nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR) was used to investigate the influence of the N‑terminus on the PPIase domain. A possible interaction of the N-terminus with the PPIase domain was further examined by cross-linking studies. Based on this data, an interaction model was subsequently constructed, demonstrating that the N-terminus can shield the catalytic center. Second, the enzymatic efficiency of Par17 for different substrates was analyzed using a protease-coupled PPIase assay. The presence of the unique part of the N-terminus of Par17 leads to a higher substrate specificity in comparison to the shorter isoform Par14. This is presumably caused by the binding of the N-terminal section to the more inefficiently catalyzed model substrates. Finally, a general approach using cross-linking, followed by co-immunoprecipitation and mass spectrometry was chosen to identify interaction partners of Par14 and Par17 and their N-termini. Due to the differences within their N‑terminal regions, for Par14 and Par17 different interaction partners were identified, which were classified into various functional groups. Par17 was found to function in internal transport, internal cell motility, lipid metabolism, amino acid metabolism and oxidative phosphorylation. Based on these results a direct interaction between Par17 and actin was demonstrated causing the protein to polymerize in a concentration dependent manner. In addition, gene knockdown experiments in cells confirmed a function of Par17 in cell migration and oxidative phosphorylation.
Peptidyl-Prolyl cis/trans-Isomerasen (PPIasen) sind wichtige Enzyme, die die Proteinfaltung beschleunigen und Proteine regulieren, die an verschiedenen zellulären Prozessen beteiligt sind. Zur Gruppe der Parvulin-ähnlichen PPIasen gehören die beiden menschlichen Isoformen Parvulin 14 (Par14) und Parvulin 17 (Par17). Sie werden durch alternative Transkriptionsinitiation von dem gleichen Gen (PIN4) transkribiert. Beide Proteine besitzen die gleiche PPIase-Domäne und den gleichen N-Terminus, wobei Par17 zusätzlich noch eine N-terminale Verlängerung von 25 Aminosäuren aufweist. Trotz dieses nur kleinen Unterschieds, kommen die beiden Parvuline in unterschiedlichen Zellkompartimenten vor. Dies legt nahe, dass die Proteine unterschiedliche Funktionen in der Zelle haben. In der bisherigen Forschung wurde kaum zwischen den beiden Isoformen unterschieden, obwohl diese Parvuline an Prozessen beteiligt sind die mit verschiedenen Krebsformen in Verbindung stehen und bei der Virusreplikation eine Rolle spielen.
Diese Arbeit untersucht deshalb nun den Einfluss der zusätzlichen 25 N-terminalen Aminosäuren von Par17 auf die Funktion und Interaktion des Enzyms. Hierzu wurde zunächst mittels Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) der Einfluss des N-Terminus auf die PPIase-Domäne untersucht. Anschließend wurde eine mögliche Interaktion des N-Terminus mit der PPIase-Domäne durch Quervernetzungsstudien weiter untersucht. Basierend auf den gewonnenen Daten wurde ein Interaktionsmodell erstellt, das zeigt, dass der N-Terminus das katalytische Zentrum abschirmen kann. Weiter wurde die enzymatische Effizienz von Par17 für verschiedene Substrate mittels eines Protease-gekoppelten PPIase-Assays analysiert. Die Anwesenheit der N‑terminalen 25 Aminosäuren von Par17 führt zu einer höheren Substratspezifität im Vergleich zur kürzeren Isoform Par14. Dies wird vermutlich durch die Bindung des N‑terminalen Abschnitts an die ineffizienter katalysierten Modellsubstrate verursacht. Abschließend wurde ein allgemeiner Ansatz mit Quervernetzung, gefolgt von Co‑Immunpräzipitation und Massenspektrometrie gewählt, um Interaktionspartner von Par14 und Par17 sowie deren N-Termini zu identifizieren. Aufgrund der Unterschiede innerhalb ihrer N‑terminalen Regionen, konnten für Par14 und Par17 unterschiedliche Interaktionspartner identifiziert werden. Diese wurden in verschiedene funktionelle Gruppen eingeteilt. Dabei konnte festgestellt werden, dass Par17 wahrscheinlich eine Funktion beim internen Transport, der internen Zellmotilität, dem Lipidstoffwechsel, dem Aminosäurestoffwechsel und der oxidativen Phosphorylierung hat. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde eine direkte Interaktion zwischen Par17 und Aktin nachgewiesen, die zu einer konzentrationsabhängigen Polymerisation des Proteins führt. Darüber hinaus bestätigten Gen-Knockdown Experimente in Zellen eine Funktion von Par17 bei der Zellmigration und der oxidativen Phosphorylierung.