In dieser Arbeit konnte erfolgreich ein in vitro Modell für die Kultivierung von Biofilmen des Bakteriums P. aeruginosa unter CF-ähnlichen Bedingungen sowie eine Beprobungs- und Analysenmethode für extrazelluläre volatile Metabolite aus diesem Modellsystem entwickelt und etabliert werden. Außerdem wurde das extrazelluläre volatile Metabolom von drei P. aeruginosa Stämmen unter CF-ähnlichen Bedingungen charakterisiert.

Hierzu wurde zunächst ein in vitro Modell zur Kultivierung von Biofilmen des Bakteriums P. aeruginosa entwickelt und etabliert. Das in vitro Biofilmmodell wurde biochemisch mit Hilfe der Stämme P. aeruginosa ATCC 10145, PAO1 und FRD1 charakterisiert. Hierfür wurden die Bakterienstämme auf LB- bzw. LBN-Agar unter aeroben bzw. anaeroben Bedingungen kultiviert und die Gesamtzellzahl und der KBE-Wert bestimmt. Sowohl unter aeroben als auch unter anaeroben Bedingungen konnten Gesamtzellzahlen von über 1∙10⁹ Zellen∙Platte^-1 bestimmt werden, so dass die Bildung von „multilayer Biofilmen“ beobachtet werden konnte [136]. Anschließend wurden die Inokulationskonzentration und die Kultivierungsdauer variiert und optimiert. Bei einer Inokulationskonzentration von 10⁵ Zellen∙cm^-2 konnten unter beiden Bedingungen optimale Ergebnisse hinsichtlich der Zellzahl erreicht werden. Die Variation der Kultivierungsdauer zeigte, dass bereits nach 24 Stunden die stationäre Wuchsphase bei beiden untersuchten Bedingungen erreicht worden ist. Damit eine zu erwartende biologische Varianz in der Wuchsgeschwindigkeit Berücksichtigung findet und eine reproduzierbare Beprobung in der stationären Wuchsphase erfolgt, wurde für die weiteren Metabolomuntersuchungen eine Kultivierungsdauer von 48 Stunden gewählt.

Damit eine Beprobung der extrazellulären volatilen Metabolite erfolgen konnte, wurde eine Dünnfilmmikroextraktionstechnik angewendet sowie für die suspected target Analyse der mVOCs aus dem in vitro Modell optimiert. Die Auswahl des Sorptionsmaterials erfolgte auf Basis der zu erwartenden Substanzklassen. Die Charakterisierung von PDMS-Sorptionsfilmen zweier Hersteller erfolgte mittels eines TG-APPI-qMS Systems. Die Filme von der Goodfellow GmbH wiesen mit 300 °C eine größere Temperaturstabilität auf. Des Weiteren konnte eine homogenere thermische Zersetzung und eine reproduzierbarere Herstellung der Filme dieses Herstellers (relative Standardabweichung Peakapex beträgt 1,7%) beobachtet werden. Die Entwicklung einer zweistufigen, lösungsmittelbasierten und thermischen Reinigung war notwendig, um die Kontaminanten zu entfernen. Eine Analyse der auf den Filmen angereicherten mVOCs wurde mit einer TD-GC-qMS Methode, welche in dieser Arbeit mit Hilfe von Standards von potenziellen Metaboliten des Bakteriums P. aeruginosa entwickelt wurde, durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass die Verwendung einer Ofenkühlung hinsichtlich der Detektion von Substanzen mit einem hohen Dampfdruck vorteilhaft ist. Des Weiteren konnte durch die Ofenkühlung eine Reduktion der Peakbreiten um ca. drei Sekunden und somit eine Erhöhung der Peakkapazität erzielt werden. Mit dieser Methode wurden Nachweis- und Bestimmungsgrenzen für mittel- und weniger polare Verbindungen im niedrigen nanomolaren Bereich (0,5 nM und 1,5 nM) bestimmt.

Anschließend wurde das Biofilmmodell sowie die entwickelte Beprobungs- und Analysemethode zu in vitro Studien zu unterschiedlichen Einflussgrößen auf das extrazelluläre volatile Metabolom eingesetzt. In dieser Untersuchung wurden verschiedene Eigenschaften der Kultivierung sowie des Bakteriums P. aeruginosa variiert, um deren Einfluss auf das extrazelluläre volatile Metabolom bei Atemwegsinfektionen im Kontext der CF-Erkrankung zu erforschen. Ein deutlicher Einfluss auf das Metabolom konnte für das Nährmedium sowie die Atmosphäre während der Kultivierung (aerob bzw. anaerob) nachgewiesen werden. Des Weiteren hat der gewählte mukoide Phänotyp des Bakteriums auf molekularer Ebene einen Einfluss. Basierend auf der Erkenntnis, dass das Nährmedium einen Einfluss auf das Metabolom hat, wurde ein festes Nährmedium entwickelt, welches die Nährstoffbedingungen in der Lunge eines CF-Patienten simuliert. Dieses artifizielle Sputummedium (ASM) wurde durch die Ermittlung der Gesamtzellzahl, des KBE-Wertes sowie des Uronsäuregehalts mikrobiologisch charakterisiert. Außerdem wurde die Kultivierungsdauer überprüft, damit analog zu den vorherigen Untersuchungen „multilayer Biofilme“ der Bakterienstämme unter aeroben und anaeroben Bedingungen kultiviert werden können. Die Versuche zur Charakterisierung des ASM zeigten, dass mittels ASM unter aeroben und anaeroben Bedingungen nach 48 Stunden Gesamtzellzahlen von über 1∙10⁹ Zellen∙Platte^-1 erreicht wurden und somit „multilayer Biofilme“ entstanden sind [136]. Des Weiteren konnte die Kultivierung des Stammes P. aeruginosa FRD1 ohne Verlust des mukoiden Phänotyps erfolgen, was durch die erhöhten Uronsäuregehalte belegt werden konnte. Nach der Entwicklung und Charakterisierung des ASM wurde das extrazelluläre volatile Metabolom des Bakterienstämme P. aeruginosa ATCC10145, PAO1 und FRD1 unter CF-ähnlichen Bedingungen im in vitro Biofilmmodell charakterisiert. In dieser Studie konnten Bakterienstamm selektive Metabolite ermittelt werden. Außerdem wiesen bei einem Vergleich der klinischen Isolate P. aeruginosa PAO1 und FRD1 Peaks von 36 Metaboliten signifikante Abweichungen der Intensitäten auf. Bei einem Vergleich der klinischen Isolate mit dem Referenzstamm konnten 28 Metabolite (P. aeruginosa PAO1) bzw. 70 Metabolite (P. aeruginosa FRD1) ermittelt werden, deren Peaks eine signifikante Abweichung (p >95%) in der Intensität aufweisen. Weiterhin konnten die Bakterienstämme mittels zweier Hauptkomponenten voneinander differenziert werden. Die Varianz der ersten Hauptkomponente lag dabei bei 33% und die der zweiten Hauptkomponente bei 58%.

Zukünftig können mit dem Biofilmmodell sowie der entwickelten Beprobungs- und Analysemethode in vitro Studien zum extrazellulären volatilen Metabolom von klinischen Stämmen des Bakteriums P. aeruginosa sowie weiterer CF-relevanter Bakterien durchgeführt werden. Hierzu eignen sich zum Beispiel die aufgrund Ihrer Prävalenz besonders bedeutsamen Bakterien S. aureus und S. maltophilia [4]. Des Weiteren könnte das Bakterium M. abscessus, welches einen besonders negativen Einfluss auf den Krankheitsverlauf der CF-Patienten hat [198], untersucht werden [4]. Weiterhin kann die Methode eingesetzt werden, um die ermittelten mVOCs der CF-relevanten Bakterien aus Mischkulturen sowie CF-Sputum zu analysieren sowie die Bakterienstämme zu differenzieren. Die gewonnen Erkenntnisse aus den in dieser Arbeit gezeigten Untersuchungen sowie zukünftigen in vitro Studien zu mVOCs von CF-relevanten Bakterien können zur Entwicklung und Etablierung einer klinischen, nicht invasiven Atemgasanalytik von CF-Patienten genutzt werden.

Bei den Analysen der mVOCs mit Hilfe der TD-GC-qMS Methode konnte in einem Retentionszeitenbereich von 17 – 30 Minuten eine Koelution von nicht aufgelösten Peaks beobachtet werden. Unterhalb dieser Peaks könnten niedrig abundante aber für das bakterielle Pathogen relevante Peaks liegen, so dass eine Auflösung dieser koeluierenden Peak notwendig erscheint. Die Auflösung solcher koeluierender Peaks ist durch die Verwendung einer komprehensiven zweidimensionalen GC, direkt gekoppelt mit einem MS, möglich [199]. Deswegen wurde eine GCxGC-qMS Methode sowie eine Flüssigextraktionsmethode für die TFME Filme entwickelt und auf das in vitro Biofilmmodell angewendet. Die Entwicklung und Optimierung der Analyse- sowie Flüssigextraktionsmethode erfolgte mit Hilfe von Standards potenzieller Metabolite des Bakteriums P. aeruginosa. Abschließend erfolgte die Analyse von den extrazellulären volatilen Metaboliten der Stämme P. aeruginosa ATCC 10145, PAO1 und FRD1 im in vitro Biofilmmodell (LB- und LBN-Agar) unter Verwendung der entwickelten Flüssigextraktions- und Analysemethode. Insgesamt konnten unter anaeroben Bedingungen sechs (P. aeruginosa ATCC 10145), fünf (P. aeruginosa PAO1) und zwei Metabolite (P. aeruginosa FRD1) für die drei untersuchten Stämme ermittelt werden. Ein Vergleich der Metabolite mit denen, welche mittels TD-GC-qMS Methode ermittelt werden konnten, zeigte, dass diese größtenteils übereinstimmen. Aufgrund der höheren Sensitivität, des geringeren Arbeitsaufwandes und der geringeren Fehleranfälligkeit ist die direkte Thermodesorption, wie von Jiang und Pawliszyn [116] postuliert, der Flüssigextraktion vorzuziehen ist.

Basierend auf den Ergebnissen, welche mit der 2D-GC-MS und dem TD-GC-MS erhalten worden sind, kann erwartet werden, dass die direkte Kopplung einer Thermodesorption mit einem GCxGC-qMS System vorteilhaft bzgl. der Detektion weiterer Bakterienstamm selektiver Metabolite ist. Diese Kopplung würde eine erhöhte Peakkapazität sowie die Trennung koeluierender Peaks durch die Verwendung einer komprehensiven 2D-GC ermöglichen. Des Weiteren könnten die auf dem TFME Film angereicherten Analyten durch thermische Desorption direkt in die GC übertragen werden, so dass Diskriminierungseffekte basierend auf unterschiedlichen Polaritäten bei einer Flüssigextraktion vermieden werden. Hierdurch könnten erfolgreich weitere niedrig abundante und selektive Metabolite ermittelt werden, welche eine Zuordnung und Differenzierung von Bakterien aus CF-Sputum oder dem Atemgas von CF-Patienten ermöglicht.