Diese Arbeit beschreibt den ersten High-Throughput-Screening (HTS)-Ansatz, der an einem Protein aus der Gruppe der cytosolischen Carboxypeptidasen (CCPs) durchgeführt wurde. CCPs wurden kürzlich als Enzyme identifiziert, die in der Lage sind, Glutamatketten von glutamylierten Proteinen zu verkürzen und damit eine Schlüsselfunktion bei der Regulierung von Glutamylierungsereignissen in der Zelle zu besitzen. Als eines der aktivsten CCPs war CCP1 das Enzym der Wahl. Zu Beginn wurde rekombinantes CCP1 in größerem Maßstab in Insektenzellen produziert, um eine ausreichende Proteinmenge zu erhalten. Aktivitätsassays an Telokin, einem der natürlichen Proteinsubstrate von CCP1, bestätigten die Funktionalität von CCP1, sodass es für Assay-Entwicklungsexperimenten verwendet wurde. Der Assay der Wahl für das anstehende HTS war der lumineszenzbasierte GlutamateGloTM-Assay. Es wurde eine Michaelis-Menten-Kinetik durchgeführt, um die katalytischen Eigenschaften von CCP1 an verschiedenen Peptidsubstraten zu bestimmen, wobei eine höhere Präferenz gegenüber Substraten mit längeren Glutamatresten festgestellt wurde. Unter Einhaltung der industriellen Qualitätsparameter wurden verschiedene Assay-Bedingungen evaluiert, was zu einem zuverlässigen, reproduzierbaren und HTS-anwendbaren Assay führte. In vorbereitenden enzymatischen Aktivitätsassays wurden der Proteasom-Inhibitor Celastrol und der Matrix-Metalloproteasen-Inhibitor Tanomastat als Inhibitoren gegen CCP1 identifiziert. Ein Pilotscreening mit ca. 4.000 Verbindungen bestätigte die Stabilität des etablierten Assays. Das folgende HTS wurde erfolgreich mit ~173.000 Verbindungen und S/B-, S/N- und Z'-Werten von 26, 26 bzw. 0,76 durchgeführt. Mit einer Trefferquote von 0,42% ergab das HTS 730 primäre Treffer mit einer Hemmungsrate von mindestens 50%. Anschließend wurden in einem Gegenscreening falsch positive Treffer identifiziert. Konzentrationsabhängige Experimente bestätigten 72 Verbindungen mit IC50-Werten unter 30 µM. Diese 72 Substanzen wurden daraufhin zur Hit-Verifizierung bei einer Konzentration in Immunoblotting-Experimenten unter Verwendung des Proteinsubstrats Telo3E und rekombinanten CCP1 getestet. 30 Verbindungen wurden als CCP1-Inhibitoren bestätigt. Dieses Panel von 30 Verbindungen wurde dosisabhängig unter Verwendung von zwei verschiedenen Proteinsubstraten getestet. Die Prozessierung von Telo3E durch CCP1 wurde von 15 Verbindungen gehemmt, während 22 Verbindungen die Glutamatfreisetzung von hoch polyglutamyliertem Tubulin aus Schweinehirn inhibierten. Da Tubulin das relevanteste Substrat von CCP1 darstellt, wurden die Verbindungen, die auf das Hirntubulin wirken, weiterverfolgt. Der GlutamateGloTMAssay wurde angewandt, um das inhibitorische Potential der Verbindungen, die bei der Reaktion von CCP1 auf das Hirntubulin aktiv waren, erneut zu überprüfen. Eine hohe Korrelation zwischen den Immunoblotting-Daten und den Daten des GlutamateGloTM-Assays unterstreichte die molekulare Inhibition von CCP1 durch diese Verbindungen. Als nächstes wurden die Verbindungen physikochemisch charakterisiert, indem der parallel artificial membrane permeability assay (PAMPA) und der Solubility-Ranking-Assay (SolRank) angewandt wurden. Zusätzlich ermöglichte der biophysikalische nano differential scanning fluorimetry (nanoDSF) Assay die direkte Bestimmung der Bindung der Verbindungen an CCP1. Letztlich wurden 13 Verbindungen ausgewählt, die moderate bis hohe Hemmungsraten bei gleichzeitig guten chemischen Eigenschaften aufwiesen. Auffallend war, dass Verbindungen, aus verschiedenen Clustern, mit Maleimid-Gruppen auf CCP1 aktiv waren. Daher wurden Maleimide als vielversprechende chemische Funktionalität identifiziert. Im Gegensatz dazu ergab die zelluläre Profilierung der biochemisch bestätigten Treffer in CCP1-überexprimierenden HEK293T-Zellen nur zwei Verbindungen, die in der Lage waren, die Bildung von Δ2tub an α-Tubulin zu hemmen. IC50-Werte von 1,7 und 9,8 µM machen diese Verbindungen für weitere Untersuchungen attraktiv. Insgesamt wurden in dieser Arbeit mehrere mögliche chemische Startpunkte für die Generierung neuartiger und pharmakologisch aktiver CCP1-Inhibitoren identifiziert.
This work describes the first high-throughput screening (HTS) approach performed on a protein belonging to the group of cytosolic carboxypeptidases (CCPs). CCPs have recently been identified as enzymes capable of shortening glutamate chains of glutamylated proteins, and thus, have a crucial function in regulating glutamylation events in the cell. As one of the most active CCPs, CCP1 was the enzyme of choice. Initially, recombinant CCP1 was produced on a larger scale in insect cells to obtain sufficient protein amounts. Activity assays on telokin, one of the natural protein substrates of CCP1, confirmed the functionality of CCP1, and it was then subjected to assay development experiments. The assay of choice for the upcoming HTS was the luminescence-based GlutamateGloTM assay. Michaelis-Menten kinetics were performed to determine the catalytic properties of CCP1 on different peptide substrates, with a higher preference toward substrates with longer glutamate residues. Specific assay conditions were evaluated while maintaining industrial quality parameters, resulting in a reliable, reproducible, and HTS-applicable assay. In preliminary enzymatic activity assays, the proteasome inhibitor, celastrol, and the matrix metalloprotease inhibitor, tanomastat, were identified as inhibitors of CCP1. A pilot screening with approximately 4.000 compounds confirmed the stability of the established HTS assay. The following HTS was successfully performed with ~173.000 compounds and S/B, S/N, and Z' values of 26, 26, and 0.76, respectively. With a hit rate of 0.42%, the HTS yielded 730 primary hits inhibiting the CCP1 activity to at least 50%. Subsequently, false-positive hits were identified in a counter screen. Doseresponse experiments confirmed 72 hits with IC50 values below 30 µM. These 72 compounds were then tested for hit verification at one concentration in immunoblotting experiments using the protein substrate Telo3E and recombinant CCP1. Thirty compounds were confirmed as CCP1 inhibitors. This panel of 30 compounds was tested in a dose-dependent manner using two different protein substrates. Processing of Telo3E by CCP1 was inhibited by 15 compounds, whereas 22 compounds inhibited the glutamate release of highly polyglutamylated porcine brain tubulin. Because tubulin is the most relevant substrate of CCP1, the compounds acting on porcine brain tubulin were further considered. The GlutamateGloTM assay was applied to reassess the inhibitory potential of the compounds on CCP1 processing brain tubulin. A high correlation between the immunoblotting and GlutamateGloTM data underscores molecular inhibition of CCP1 by these compounds. The compounds were then characterized for physicochemical properties using the parallel artificial membrane permeability assay (PAMPA) and the solubility ranking assay (SolRank). In addition, a biophysical nano differential scanning fluorimetry (nanoDSF) assay allowed direct assessment of binding of the compounds to CCP1. Finally, 13 compounds were selected that exhibited moderate to high inhibition rates along with good chemical properties. Strikingly, compounds, from different clusters, harboring maleimide groups were active on CCP1. Therefore, maleimides were highlighted as promising chemical entities. In contrast, cellular evaluation of biochemically confirmed hits in CCP1- overexpressing HEK293T cells revealed only two compounds that inhibited the generation of Δ2tub on α-tubulin. IC50 values of 1,7 and 9,8 µM prove these compounds attractive for further investigation. Overall, this work identified several potential chemical starting points for the generation of novel and pharmacologically active CCP1 inhibitors.
