Generierung und Charakterisierung von Cytomegalovirus-Mutanten als Expressions- und Impfstoffplattformen für heterologe Virusproteine

Viren haben im Laufe der Evolution mannigfaltige Immunevasionsmechanismen entwickelt, um den Restriktionsfaktoren des Wirtes entgegenzuwirken. Um eine effiziente Replikation zu ermöglichen, kodieren viele Viren für Adapter-Proteine, die das zelluläre DNA damage-binding Protein1 (DDB1) und assoziierte Cullin-RING-Ligase-Komplexe ausnutzen und für die proteasomale Degradation von antiviralen Restriktionsfaktoren zweckentfremden. Ziel dieser Arbeit war es, die biologischen Funktionen von verschiedenen, viralen DDB1-interagierenden Proteinen zu untersuchen. Mittels Transkomplementationsanalyse wurde studiert, ob ein wichtiges DDB1-interagierendes Protein durch die heterologe Expression sequenzhomologer oder funktionell analoger Proteine aus anderen Viren ersetzt werden kann. Im Mittelpunkt der Studie stand die Deletionsmutante des murinen Cytomegalovirus (MCMV), welche aufgrund des Funktionsverlustes des DDB1-interagierenden Proteins M27 nicht mehr in der Lage ist, die Interferon (IFN)-induzierte Immunantwort zu inhibieren und deshalb sehr stark attenuiert ist. Zunächst wurden per BAC-Mutagenese virale Fremdgene, die für (I) sequenzhomologe, cytomegalovirale Proteine (pUL27 [HHV-5] und pR27 [MuHV-2]) und (II) bekannte DDB1-interagierende Virusproteine (HBx [HBV] und WHx [WHV]) kodieren, in das MCMV-Genom eingebracht. Mithilfe der Mutanten ΔM27-M27HA, ΔM27-UL27HA, ΔM27-R27HA, ΔM27-HBxHA und ΔM27-WHxHA wurde analysiert, ob der ΔM27-Phänotyp zumindest teilweise durch diese heterologe Expression kompensiert wird. Keines der fremd exprimierten viralen Proteine minderte die Phänotypen von ΔM27-MCMV. Ausschließlich die Resinsertion von M27 stellte die Degradation von STAT2, die Inhibition der IFN-induzierten Signaltransduktion und die relative Unempfindlichkeit gegenüber IFNγ wieder her. Zusätzlich beeinträchtigte die heterologe Expression von pUL27HA, pR27HA, HBxHA und WHxHA die Replikationseffizienz von ΔM27-MCMV. Die Infektion mit ΔM27-HBxHA und ΔM27-WHxHA führte sogar zu einer vergleichsweise höheren Aktivität des ISRE-Promotors. Die Studie legt nahe, dass pM27 ein hochspezialisiertes Protein ist, dessen Funktion weder durch die Sequenz-Homologa pUL27 bzw. pR27 noch durch die hepadnaviralen DDB1-interagierenden Proteine HBx und WHx komplementiert werden. Die M27-Deletionsmutante ist stark attenuiert. Anhand der Transkomplementationsanalyse wurde deutlich, dass dieser Zustand sehr stabil ist, selbst bei Expression fremder, homologer oder analoger Virusproteine. Daher scheint ΔM27-MCMV ein geeigneter Vakzinvektor in der Maus zu sein. In der vorliegenden Arbeit wurden außerdem M27-positive und M27-defiziente MCMV-Vektoren generiert, welche das immunogene HBsAg von HBV exprimieren. Es konnte gezeigt werden, dass eine prophylaktische Vakzinierung sowohl mit MCMV-HBsAg als auch mit ΔM27-HBsAg im hydrodynamischen Injektionsmodell in der Maus vor HBV schützt. Die Vakzinierung mit MCMV-HBx zeigte hingegen keinen schützenden Effekt gegen HBV.

During evolution, viruses have developed multiple immune evasion mechanisms to counteract the host's restriction factors. To enable efficient replication, many viruses encode adapter proteins that exploit cellular DNA damage-binding protein 1 (DDB1) and associated cullin-ring ligase complexes and alienate them for proteasomal degradation of antiviral restriction factors. The aim of this work was to investigate the biological functions of different viral DDB1-interacting proteins. By means of transcomplementation analysis, we studied whether an important DDB1-interacting protein can be replaced by the heterologous expression of sequence homologous or functionally analogous proteins from other viruses. The study focused on the deletion mutant of the murine cytomegalovirus (MCMV), which is no longer able to inhibit the interferon (IFN)-induced immune response due to the loss of function of the DDB1-interacting protein M27 and is therefore highly attenuated. First, foreign viral genes coding for (I) sequence-homologous cytomegaloviral proteins (pUL27 [HHV-5] and pR27 [MuHV-2]) and (II) known DDB1-interacting viral proteins (HBx [HBV] and WHx [WHV]) were introduced into the MCMV genome by BAC mutagenesis. Using the mutants ΔM27-M27HA, ΔM27-UL27HA, ΔM27-R27HA, ΔM27-HBxHA and ΔM27-WHxHA, it was analyzed whether the ΔM27 phenotype is at least partially compensated by this heterologous expression. None of the foreign expressed viral proteins reduced the phenotypes of ΔM27-MCMV. Only the resinsertion of M27 restored the degradation of STAT2, the inhibition of IFN-induced signal transduction and the relative insensitivity to IFNγ. Additionally, heterologous expression of pUL27HA, pR27HA, HBxHA and WHxHA impaired the replication efficiency of ΔM27-MCMV. Infection with ΔM27-HBxHA and ΔM27-WHxHA even led to a comparatively higher activity of the ISRE promoter. The study suggests that pM27 is a highly specialized protein whose function is not complemented by the sequence homologues pUL27 or pR27 or by the hepadnaviral DDB1-interacting proteins HBx and WHx. The M27-deletion mutant is highly attenuated. Transcomplementation analysis showed that this state is very stable, even when foreign, homologous or analogous viral proteins are expressed. Therefore ΔM27-MCMV seems to be a suitable vaccine vector in the mouse. In the present work, M27-positive and M27-deficient MCMV vectors were generated, which express the immunogenic HBsAg of HBV. It could be shown that prophylactic vaccination with both MCMV-HBsAg and ΔM27-HBsAg protects against HBV in the HBV hydrodynamic injection model in the mouse. However, vaccination with MCMV-HBx did not show a protective effect against HBV.

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