Regulation of the Ctf19/CCAN protein complex at the budding yeast kinetochore
Eine korrekte Chromosomen-Mikrotubuli Bindung ist ausschlaggebend für eine akkurate mitotische und meiotische Zellteilung in allen lebenden eukaryotischen Organismen. Die proteinreichen Strukturen, die für eine korrekte Anheftung der Chromosomen an die Mikrotubuli verantwortlich sind, werden Kinetochore genannt. Kinetochore sind Multiprotein-Komplexe, die eine Plattform für die Spindel darstellen und an den Zentromeren der Chromosomen gebildet werden. Dort ermöglichen sie eine exakte Verteilung der Schwesterchromatiden in Mitose und der homologen Chromosomen in Meiose I. In der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae bindet ein einziger Mikrotubulus an ein spezialisiertes Zentromer-assoziiertes Nukleosom, welches die Histon H3-Variante Cse4/CENP-A enthält. Der Aufbau von Kinetochoren in der Bäckerhefe muss zeitlich und räumlich reguliert sein, sodass eine Bi-Orientierung der Mikrotubuli direkt nach Replikation des Zentromers gewährleistet ist. Bislang ist nicht ausreichend verstanden, wie der effiziente Aufbau von Kinetochoren mit dem Fortschreiten des Zellzyklus verknüpft ist. In dieser Arbeit werden neue Erkenntnisse präsentiert, die eine phosphorylierungsabhängige Regulation der CCAN-Untereinheit Ame1/CENP-U (bildet eine Untereinheit des COMA-Komplexes) aufdecken. Die Phosphorylierung von Ame1 beeinflusst weder die Protein-Protein Interaktion von Ame1 mit dem Mtw1c (Komplex des äußeren Kinetochors) oder dem essentiellen CCAN-Protein Mif2, noch die DNA-Bindung an Zentromer-DNA. In biochemischen und genetischen Experimenten wurde dagegen gezeigt, dass die CDK-Phosphorylierung von Ame1 für die Regulation des Proteinlevels verantwortlich ist. Dies ist vor allem in Überexpressions-Analysen bestätigt worden, bei der ein erhöhtes Proteinlevel von Ame1/Okp1 das Zellwachstum beeinträchtigt. Die Phosphorylierung von Ame1 an den Aminosäureresten Ser41/Ser45 und Ser52/Ser53 ist abhängig von Cdc28/Clb2 und bildet sogenannte Phospho-Degron Motive aus, die von der E3 Ubiquitin Ligase SCF mit dem Phospho-Adapter Protein Cdc4 erkannt werden. In Zellzyklus-Analysen wurde außerdem bestätigt, dass diese Phospho-Degron Motive schrittweise und Zellzyklus-abhängig aktiviert werden, sodass in M-Phase eine vollständige Phosphorylierung vorliegt, die zu einer Ubiquitinierung von Ame1 führt. Wenn Ame1 an den Mtw1 Komplex gebunden wird, ist die Phosphorylierung und damit verbunden der Abbau von Ame1 verhindert. Dies stellt einen Sicherheitsmechanismus dar, sodass nur Ame1/Okp1 Komplexe abgebaut werden, die frei im Zellkern vorkommen und dazu fähig wären den potentiell gefährlichen Kinetochor-Aufbau abseits des Zentromers zu begünstigen. Die künstliche Verstärkung des Phospho-Degron Motivs in Ame1 mittels gezielter Mutationen, beeinträchtigt das Zellwachstum von Wildtypzellen aber kann gleichzeitig den Wachstumsphänotyp in cdc4 Mutanten teilweise unterdrücken. Des Weiteren wurde gezeigt, dass auch Mcm21, eine weitere Untereinheit des COMA Komplexes, Zellzyklus-abhängig phosphoryliert wird und dass die Überexpression von COMA Komplexen das Zellwachstum noch stärker beeinträchtigt. Neben diesem regulatorischen Mechanismus wurde eine weitere Bindungsstelle am C-terminalen Ende von Ame1 identifiziert, die für die Protein-Protein Interaktion von Ame1/Okp1 mit dem Heterodimer Nkp1/Nkp2 verantwortlich ist. In dieser Arbeit wird ein neuer Regulations-Mechanismus vorgestellt, der durch CDK-Phosphorylierung Degron Motive aktiviert und dadurch die Ubiquitinierung von Kinetochor-Proteinen durch die E3 Ligase SCFCdc4 erlaubt.