Survivin, also known as BIRC5 (baculoviral IPA repeat-containing 5), is highly upregulated in most cancer entities and has been associated with a resistance against chemo- and radiotherapy. Besides its role as a member of the CPC (chromosomal passenger complex) and its role during mitosis, Survivin also belongs to the IAP (inhibitor of apoptosis) family, and as such fulfils a role as an inhibitor of apoptosis predominantly within the cytoplasm. During mitosis, the CPC is responsible for correction of chromosome-microtubule attachment errors, activation of the spindle assembly checkpoint as well as construction and regulation of the contractile apparatus that drives cytokinesis (Carmena et al. 2012b). However, Survivin’s and the other CPC members’ specific function in interphase still remains elusive.
Therefore, in this thesis localisation of the CPC in interphase was confirmed and co-immunoprecipitations and PLA could verify the interaction to the sliding clamp factor PCNA. PCNA is a key member of a replication fork by enhancing the processivity of the Polymerase δ. Thus, a direct interaction with the replication machinery was demonstrated. Next, DNA combing assays should reveal if CPC depletion leads to impact on ongoing replication machinery. Especially Aurora B depletion leads to an increase of asymmetric replication forks. Under normal circumstances, replication forks concur obstacles such as DNA lesions and stall at these sites of DNA damage. Through monoubiquitination of PCNA by Rad6 and Rad18, so-called transletion polymerases resumed the job as the active polymerase and replicate over these DNA lesions (Jones and Petermann 2012). Afterwards, the translesion polymerase leaves the DNA strand and the replicative polymerase is restored and DNA synthesis can proceed. Moreover, we could show an increased relocation of the CPC to the centromeres and an enhanced co-localisation to PCNA after irradiation. Since the translesion process is DNA-damaged induced, we supposed that the CPC was directly involved in the switching-process of polymerases at stalled replication forks. Therefore, we performed expression analysis of Polymerase η after CPC depletion in combination with co-immunoprecipitations. We could indeed demonstrate an Aurora B-dependent expression of Polymerase η and co-immunoprecipitations revealed a direct interaction of the CPC to Polymerase η. Detecting not only the overexpressed but also the endogenous proteins in polymerase η-immunoprecipitates corroborated our hypothesis.
Further experiments should confirm if depletion of CPC members provokes replication stress, which could not be counteracted by translesion synthesis. Metaphase spreads, 53BP1 nuclear bodies and mitotic DNA synthesis revealed an increase of under-replicated sites after S phase exit. Indeed, Survivin depletion induced an increase of gaps and breaks on metaphase chromosomes, representing under-replicated sites or damaged DNA which was not properly processed. Moreover, these under-replicated sites were visible in so-called 53BP1 nuclear bodies. 53BP1 protects damaged DNA by accumulated at damaged DNA sites. Our data revealed an increase of 53BP1 nuclear bodies, which is a hint for perturbed or interrupted replication in S phase. Furthermore, the suggestion that CPC depletion leads to an increase of damaged-induced replication stress, is confirmed by an increase of mitotic DNA synthesis. Normally, the doubling of DNA is finished before the exit of S phase. In our case, replication could not be completed properly and cells with under-replicated-sites entered mitosis.
In summary, we can conclude that the CPC, and especially Survivin, are necessary to mediate translesion synthesis in order to preclude replication fork collapses and thus DSB formation. Furthermore, our data suggests that Survivin revives its prominent role as a radio resistance factor with its newly detected function in translesion synthesis.
Survivivn, auch bekannt als BIRC5 (baculoviral IPA repeat-containing 5), ist in den meisten Krebsentitäten vermehrt exprimiert, was mit einer erhöhten Resistenz gegen Radio und Chemotherapie einhergeht. Neben seiner Rolle als Mitglied des CPC‘s und seiner damit assoziierten Funktion in der Mitose, ist Survivin auch ein Teil der IAP Familie, und führt seine Rolle als Inhibitor der Apoptose dementsprechend vornehmlich im Zytoplasma aus. Während der Mitose ist der CPC hauptverantwortlich für die Korrektur von Anheftungsfehlern der Mikrotubuli an die Chromosomen, der Aktivierung des Kontrollpunkts der Spindelanordnung sowie der Bildung und Regulierung des kontraktilen Apparates, welcher schließlich die Zytokinese vorantreibt. Nichtsdestotrotz ist die biologische Funktion von Survivin und des CPC in der Interphase weiterhin nicht im Detail geklärt. Daher wurde im Rahmen dieser Arbeit zunächst die Interaktion des CPC mit dem Ringklemmenprotein PCNA mittels Co-Immunopräzipitation und PLA-Assays zweifelsfrei bestätigt. PCNA ist als essentieller Teil der Replikationsgabel für eine verstärkte DNA-Bindung der Polymerase δ verantwortlich und gewährleistet so eine kontinuierliche Strangsynthese. Somit konnten wir eine direkte Verbindung des CPC an die Replikationsmaschinerie aufzeigen. Als nächstes sollten daher DNA combing Assays darüber Aufschluss geben, ob eine Depletion von CPC Mitgliedern die Replikationsmaschinerie beeinflusst. In der Tat führte insbesondere eine Depletion von Aurora B zur Ausbildung asymmetrischer Replikationsgabeln. Normalerweise führen Hindernisse wie beispielsweise DNA-Läsionen während der Replikation zu einem Anhalten der Maschinerie. Ausgelöst durch eine über Rad6 and Rad18 vermittelte Mono-Ubiquitinierung von PCNA übernimmt eine sogenannte TransläsionsPolymerase deren Aufgabe innerhalb der Replikationsgabel und repliziert ausschließlich diese DNA-Läsionen. Danach verlässt die Transläsions-Polymerase den DNA-Strang, und die replikative Polymerase setzt, zurück an ihrem Ursprungsort, die Synthese fort. Weiterhin konnten wir eine Verlagerung des CPC‘s in Richtung der Zentromere und zeitgleich einen Anstieg der CPC-PCNA Interaktion nach Bestrahlung demonstrieren. Da der Tranläsions-Prozess mit der Entstehung von DNA-Schäden assoziiert ist, ist anzunehmen, dass der CPC direkt am Wechselprozess der unterschiedlichen Polymerasen an blockierten Replikationsgabeln beteiligt ist. Um diese These zu untermauern, wurde die Expression der Polymerase η nach CPC- Depletion und Bestrahlung genauer untersucht. In der Tat zeigte sich eine Aurora Babhängige Expression der Polymerase η. Parallel durchgeführte CoImmunopräzipitationen konnten zudem eine direkte Interaktion der Polymerase η nicht nur mit überexprimierten CPC Mitgliedern, sondern auch mit den endogenen CPC Proteinen aufzeigen.So lag die Annahme nahe, dass die Depletion einzelner CPC-Mitglieder zu Replikationsstress führt, welcher mittels Transläsions-Synthese nicht reguliert und aufgelöst werden kann. Hierzu wurden Metaphasen-Präparationen angefertigt sowie 53BP1-Kernkörper und mitotische DNA-Synthese analysiert, und es zeigte sich in der Tat einen Anstieg von nicht-vollständig replizierten Genmaterial nach Beendigung der S-Phase. Dies war in Form von Lücken und Brüchen in Metaphase-Chromosomen nachweisbar, welche nicht-vollständig replizierte DNA repräsentieren. Diese DNALücken sind zudem in der G1-Phase des Zellzyklus als 53BP1-Kernkörper zu erkennen. 53BP1 akkumuliert an Bereichen der DNA, die beschädigt sind oder nicht richtig repliziert wurden. Weiterhin verursachte die Depletion von Survivin einen Anstieg der mitotischen DNA-Synthese. Normalerweise wird die Replikation innerhalb der S-Phase abgeschlossen, sodass die Zelle mit einem vollständig verdoppelten Genomsatz in die Mitose gelangt. Die Depletion von Survivin führte nun dazu, dass die Zelle die Replikation in der Mitose beenden musste, da diese in der S-Phase gestört bzw. unterbrochen wurde.Zusammenfassend kann man sagen, dass der CPC, und insbesondere Survivin, notwendig sind, um die Transläsions-Synthese zu ermöglichen und so Doppelstrangbrüche durch den Kollaps von Replikationsgabeln zu verhindern. Diese neu entdeckte Funktion innerhalb der Transläsions-Synthese unterstreicht ein weiteres Mal die Bedeutung von Survivin als Stahlenresistenz-Faktor in der Krebstherapie.
