Rational targeting of Survivin's nuclear export signal by supramolecular ligands : Enhancement of NES binder specificity
The protein Survivin is overexpressed in most types of cancer and considered a cytoprotective factor, correlating with resistance against chemo- and radiotherapy. As Survivin is mostly absent in normal resting tissues, it is a very cancer-specific protein and its increased occurrence in tumor cells has been associated with poor patient prognosis. Survivin features a nuclear export signal (NES) 89VKKQFEELTL98, which is recognized by the export receptor Crm1. This protein-protein interaction is not only required for the cytoprotective activity of Survivin, but also pivotal for its mitotic function. Thus, it represents a promising target for cancer research and therapy. Since Crm1 does not only serve as an export receptor for Survivin but has many different cargos, targeting Crm1 does not specifically inhibit the interaction with Survivin. So far, most Crm1 inhibitors revealed dose-limiting toxicity and severe side effects as they interfere with a variety of cargo proteins. Instead, this thesis aimed to specifically target the NES on Survivin’s surface using amino acid-selective, supramolecular tweezers. Although the basic tweezer molecules already selectively bind to surface-exposed lysine residues, additional modifications were introduced to shield Survivin’s NES region, thereby blocking Crm1.
First, tweezers were modified with small peptides (ELTL and ELTLGEFL) that were derived from Survivin’s homodimerization interface, which partly overlaps with the NES. Binding of the peptide-modified tweezers to lysines in and near Survivin’s NES was verified by NMR titrations and further strengthened by MD and QM/MM calculations. The peptide modifications of the tweezer did not only increase its affinity for Survivin as evidenced by ITC, but also enhanced its inhibitory effect on the Survivin/Crm1 interaction as shown in pull-down and fluorescence anisotropy experiments. The regioselectivity and signal-specificity of the peptide-modified tweezers were further confirmed using a Survivin point mutant (K90/103T) lacking putative anchor lysines of the tweezer and additionally by using a tweezer with the scrambled peptide sequence LFEEGLLT.
Furthermore, bivalent tweezer molecules were developed based on oligomer scaffolds that connected two tweezer units. These molecules aimed to target one lysine on each side of the NES simultaneously. ITC and pull-down experiments confirmed that the oligomer double tweezers bind to Survivin and impair the interaction between Survivin and Crm1 even better than the peptide-modified tweezers. Last, tweezers were attached to the surface of cell-permeable ultra-small gold nanoparticles. ITC experiments revealed binding of the tweezer-modified nanoparticles to Survivin with low micromolar affinity and, thus, demonstrated the integrity of the tweezers after fixation on the particle. Hence, they might be further explored to facilitate cellular uptake of other tweezer molecules, e.g. the peptide-modified or double oligomer tweezers.
In sum, the molecular tweezer seems to be well suited to address the NES epitope on Survivin’s surface and to interfere with the Survivin/Crm1 interaction. Thus, it might indeed be a promising approach for the development of novel supramolecular cancer therapies.
Das Protein Survivin wird in nahezu allen Krebsarten überexprimiert und als zytoprotektiver Faktor betrachtet, der mit einer Resistenz gegenüber Chemo- und Strahlentherapie einhergeht. Da Survivin in den meisten normalen, ausdifferenzierten Zellen nicht vorkommt, ist es ein sehr krebsspezifisches Protein und sein erhöhtes Vorkommen in Tumorzellen wird mit schlechten Prognosen für den Patienten assoziiert. Survivin verfügt über ein Kernexportsignal 89VKKQFEELTL98, welches von dem Exportrezeptor Crm1 erkannt wird. Diese Protein-Protein-Interaktion ist nicht nur für die zytoprotektive Aktivität von Survivin notwendig, sondern auch für seine mitotische Funktion. Daher stellt sie ein vielversprechendes Ziel für die Krebsforschung und –therapie dar. Da Crm1 nicht nur als Exportrezeptor für Survivin dient, sondern viele verschiedene Proteine exportiert, inhibiert eine Therapie, die auf Crm1 abzielt, nicht spezifisch die Survivin-Interaktion. Die meisten bisherigen Crm1-Inhibitoren zeigen dosislimitierende Toxizität und drastische Nebenwirkungen, da sie viele verschiedene Frachtproteine von Crm1 beeinflussen. Ziel dieser Arbeit war es stattdessen, das Kernexportsignal von Survivin spezifisch mit Aminosäure-selektiven, supramolekularen Pinzetten zu adressieren. Obwohl die einfachen Pinzettenmoleküle bereits selektiv an Oberflächen-exponierte Lysine binden, wurden zusätzliche Modifizierungen vorgenommen, um das Kernexportsignal abzuschirmen und die Interaktion mit Crm1 zu inhibieren.
Als erstes wurden die Pinzetten mit kleinen Peptiden (ELTL und ELTLGEFL) ausgestattet, die von Survivins Dimerisierungsregion inspiriert wurden, welche teilweise mit dem Kernexportsignal überlappt. Die Bindung der Peptid-Pinzetten an Lysine in und neben dem Kernexportsignal wurde mit NMR verifiziert und mithilfe von MD und QM/MM Berechnungen bestärkt. Die Peptidmodifizierung hat nicht nur die Affinität der Pinzetten für Survivin erhöht, wie mit ITC gezeigt wurde, sondern auch deren inhibitorisches Potential für die Interaktion mit Crm1 in Pulldown- und Fluoreszenzanisotropie-Experimenten verbessert. Die Regioselektivität und Signalspezifität der Peptid-Pinzetten wurden mithilfe einer Survivin-Mutante (K90/103T), bei welcher die vermutlichen Anker-Lysine für die Pinzetten fehlen, sowie einer Pinzette, deren Aminosäuresequenz durchmischt wurde (LFEEGLLT), nachgewiesen.
Zusätzlich wurden bivalente Pinzettenmoleküle auf Basis von Oligomergerüsten entwickelt, welche zwei Pinzetteneinheiten verbinden. Diese Moleküle zielen darauf ab, je ein Lysin auf beiden Seiten des Kernexportsignals gleichzeitig zu binden. ITC und Pulldown-Experimente zeigten, dass diese Oligomer-Doppelpinzetten an Survivin binden und die Interaktion mit Crm1 sogar stärker als die Peptid-Pinzetten schwächen. Als letztes wurden Pinzettenmoleküle auf der Oberfläche von zellgängigen Goldnanopartikeln verankert. ITC-Experimente zeigten eine Bindung mit niedriger, mikromolarer Affinität der Pinzetten-modifizierten Nanopartikel an Survivin und somit die Intaktheit der Pinzetten nach der Fixierung auf den Partikeln. Daher könnten sie in Zukunft verwendet werden, um die zelluläre Aufnahme anderer Pinzettenmoleküle, z.B. der Peptid- oder Oligomer-Doppelpinzetten, zu ermöglichen.
Zusammengefasst scheinen die Pinzetten gut geeignet zu sein, um das Kernexportsignal von Survivin zu adressieren und die Survivin-Crm1-Interaktion zu stören. Daher stellen sie einen vielversprechenden Ansatz für die Entwicklung von neuartigen supramolekularen Krebstherapien dar.