Heparan sulfates as regulators of articular cartilage integrity and cell-matrix interactions
A previous study demonstrated that Col2-rtTA-Cre;Ext1e2fl/e2fl, Col2-Cre;Ndst1fl/fl and Ndst1+/- mice are protected from OA development. In samples from Ndst1+/- animals, decreased amounts of ADAMTS- and MMP-specific aggrecan neo-epitopes and a reduced gelatinase activity were detected. In the study presented here, a decreased gelatinase activity was confirmed and attributed to Mmp2. Since Mmp2 expression was unaltered, protease activity is regulated on protein rather than on expression level. Additionally, preliminary results showed that Mmp9 activity is similarly decreased. Attenuated cartilage degradation due to decreased protease activity is likely one of the mechanisms underlying the protective effect seen in these mice. The attenuated development observed in Col2-rtTA-Cre;Ext1e2fl/e2fl, Col2-Cre;Ndst1fl/fl and Ndst1+/- mice raises the question if other mouse strains with altered HS modification patterns are also protected from OA and whether the same molecular mechanisms are involved. To answer this, Glce+/- and Hs2st1+/- mice as well as their wild type littermates were aged and analysed for signs of OA at 6m and 18m. At both stages no spontaneous development of OA could be detected. Surgical induction of OA by DMM showed that OA progression is not accelerated in Glce+/- and Hs2st1+/- mice. Still, due to the low OA scores induced by DMM a possible protective effect remains unclear.
In addition to a protection from OA progression Col2-rtTA-Cre;Ext1e2fl/e2fl animals display clusters of enlarged, morphologically distinct HS-deficient cells in the AC. These cells are surrounded by an excessive amount of matrix of aberrant composition, including an increased aggrecan content. Investigation of the mechanical properties of the ECM of Col2-rtTA-Cre;Ext1e2fl/e2fl mice by AFM showed that the wild type-like matrix outside the clusters was slightly stiffer compared to the AC of Ext1e2fl/e2fl mice. The ECM directly surrounding the clusters displayed a massively altered quality and was outside of the measurement range. To overcome this limitation, a mouse mutant with a hypomorphic allele of Ext1 was investigated. The GP cartilage of the Ext1gt/gt mutant was softer compared to the Ext1+/+ control. The altered compressive properties of the AC may thus be another underlying cause resulting in the protective effect against OA seen in Col2-rtTA-Cre;Ext1e2fl/e2fl animals. This leads to the question how chondrocytes sense the PG content of their surrounding matrix and how the cells react to an altered composition.
Preliminary results indicated an upregulation of the integrin pathway components FAK, pFAK, pERK and MHCII in HS-deficient cells of Col2-rtTA-Cre;Ext1e2fl/e2fl mice. This was confirmed by immunostaining against additional integrin pathway components. ItgB1, ERK and Src, were highly expressed in the clusters of mutant chondrocytes as well. To analyse the effect of an inhibited HS function on cellular processes, primary murine embryonic fibroblasts (MEFs) were treated with the HS-antagonist Surfen. This showed delayed adhesion of MEFs upon loss of HS function at early time points (0.5, 1, 2h) while the cells were able to overcome this limitation later (16h, 24h). Life cell imaging of the early adhesion process showed the formation of thin, filopodia-like membrane protrusions in an increased fraction of cells in the Surfen-treated samples. Additionally, cell migration and polarisation were reduced and the proportion of cells detaching from the plate surface increased in the presence of Surfen. The adaptor protein Paxillin and the Actin cytoskeleton were visualised. After 1h of adhesion, the proportions of MEFs forming FA and SF were reduced in presence of Surfen. The cells recovered after 24h. Together the findings point to a compensatory mechanism rescuing cell adhesion in absence of HS function. This is backed up by the finding that addition of Surfen to already adhered MEFs increases the proportion of cells forming FA and SF. These effects were not regulated by FAK, since protein level and phosphorylation status of FAK were unaltered between Surfen-treated samples and controls.
Matrix composition is also monitored by other pathways besides integrin signalling. The Hippo pathway is known for mechano-sensing of substrates and is mediated through YAP. In Surfen-treated MEFs, a shift of YAP to the cytoplasm was detected after 1h and 24h of adhesion. Its localisation was not affected by the subsequent addition of Surfen to already adhered cells, showing that the translocation of YAP to the cytoplasm is adhesion dependent. Since the phosphorylation of YAP was unaltered, the shift of YAP to the cytoplasm was regulated by a phosphorylation independent mechanism.
Die eingeschränkte Entwicklung von OA in Col2-rtTA-Cre;Ext1e2fl/e2fl, Col2- Cre;Ndst1fl/fl und Ndst1+/- Mäusen führte zu der Frage, ob andere Mausstämme mit veränderten Sulfatierungsmustern von Heparansulfaten (HS) ebenfalls vor OA geschützt sind und welche molekularen Mechanismen daran beteiligt sein könnten. Um diese Fragestellung zu beantworten wurden Glce+/- und Hs2st1+/- Mäuse sowie ihre Wildtyp-Geschwistertiere gealtert und im Alter von 6 Monaten und 18 Monaten auf das Auftreten von OA hin untersucht. In beiden Altersstufen konnte keine spontane Entwicklung von OA festgestellt werden. Die chirurgische Induktion von OA durch die Destabilisierung des medialen Meniskus zeigte, dass die Entwicklung von OA in Glce+/- und Hs2st1+/- Mäusen nicht beschleunigt ist. Durch die niedrigen OA Werte, die durch die Operation ausgelöst wurden, konnte ein protektiver Mechanismus jedoch nicht nachgewiesen werden.
Zusätzlich zum Schutz vor OA zeigen Col2-rtTA-Cre;Ext1e2fl/e2fl Tiere das Auftreten von gruppierten vergrößerten und morphologisch abgrenzbaren HS-defizienten Zellen im artikulären Knorpel. Diese Zellen sind umgeben von einer abweichend zusammengesetzten extrazellulären Matrix (ECM), die einen erhöhten Aggrecan Anteil enthält. Die Untersuchung der mechanischen Eigenschaften der Knorpelmatrix von Col2-rtTA-Cre;Ext1e2fl/e2fl Tieren durch Atomic Force Microscopy (AFM) zeigte, dass die Wildtyp-ähnliche Matrix der HS-synthetisierenden Zellen etwas fester war als bei Ext1e2fl/e2fl Mäusen. Die ECM der HS-defizienten Gruppen hatte jedoch eine stark veränderte Qualität außerhalb des Messbereichs. Um diese Einschränkung zu umgehen wurde eine Mausmutante mit einem hypomorphen Ext1- Allel analysiert. Der Wachstumsknorpel der Ext1gt/gt Mutante war im Vergleich zur Ext1+/+ Kontrolle weicher. Die veränderte Kompressionsfähigkeit des artikulären Knorpels könnte ein weiterer Mechanismus sein, der dem Schutz von Col2-rtTA-Cre;Ext1e2fl/e2fl Tieren vor OA zugrunde liegt.
Dies führt zu der Frage, wie die Chondrozyten ihre umgebende ECM wahrnehmen und wie sie auf Änderungen der Matrixkomposition reagieren. Vorläufige Ergebnisse wiesen darauf hin, dass FAK, pFAK, pERK and MHCII, Faktoren aus dem IntegrinSignalweg, in den HS-defizienten Zellen hochreguliert waren. Dies konnte durch Immunodetektion von weiteren Integrin-Signalweg Proteinen bestätigt werden. β1- Integrin, ERK und Src waren in den Gruppen mutanter Chondrozyten ebenfalls hoch exprimiert.
Um analysieren zu können, wie sich der Verlust der HS-Funktion auf zellbiologische Prozesse auswirkt, wurden primäre murine Fibroblasten (MEFs) mit dem HSAntagonisten Surfen behandelt. Dies zeigte eine verlangsamte Zelladhäsion zu frühen Zeitpunkten (0,5h, 1h, 2h), welche jedoch zu späteren Zeitpunkten (16h, 24h) von den Zellen ausgeglichen wurde. Life Cell Imaging Aufnahmen der frühen Adhäsionsphase zeigte in Anwesenheit von Surfen die Ausbildung dünner, Filopodien-artiger Membranfortsätze bei einem erhöhten Anteil von Zellen. Zusätzlich waren Migration und Polarisation der behandelten Zellen eingeschränkt und ein erhöhter Anteil von Zellen löste sich vom Untergrund ab. Die Visualisierung des Adaptor-Proteins Paxillin und des Aktin-Zytoskeletts zeigten nach 1h außerdem einen verringerten Anteil von Zellen, die Fokaladhäsionen (FA) oder Stressfasern (SF) gebildet hatten. Diese Veränderung konnte von den Zellen innerhalb von 24h ausgeglichen werden. Zusammengenommen weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass die durch den Verlust der HS-Funktion eingeschränkte Zelladhäsion durch einen kompensatorischen Mechanismus wiederhergestellt wird. Dies wird dadurch untermauert, dass das Hinzufügen von Surfen zu bereits adhärierten Zellen den Anteil von Zellen, die FA und SF ausbilden, ansteigen lässt. Dieser Effekt wird nicht durch Focal Adhesion Kinase (FAK) vermittelt, da Proteinmenge und Phosphorylierungsstatus in den behandelten Zellen unverändert waren. Die Zusammensetzung der ECM wird zusätzlich zu Integrin-abhängigen Prozessen auch durch andere Signalwege überwacht. Der Hippo-Signalweg ist für die Mechano-Rezeption von Adhäsionssubstraten bekannt und wird durch das intrazelluläre Protein YAP vermittelt. In mit Surfen behandelten MEFs wurde nach 1h sowie nach 24h eine in das Zytoplasma verlagerte Lokalisation von YAP festgestellt. Die Lokalisation des Proteins wurde jedoch nicht durch eine nachträgliche Zugabe von Surfen zu bereits adhärierten Zellen beeinflusst. Dies zeigt, dass die Translokation von YAP ins Zytoplasma abhängig vom Adhäsionsprozess geschah. Da der Phosphorylierungsstatus von YAP in den behandelten Zellen unverändert war, wurde die Verlegung von YAP ins Zytoplasma durch einen Phosphorylierungsunabhängigen Mechanismus kontrolliert.