In einer früheren Studie wurde gezeigt, dass Col2-rtTA-Cre;Ext1e2fl/e2fl, Col2- Cre;Ndst1fl/fl und Ndst1+/- Mäuse vor der Entwicklung von Osteoarthrose (OA) geschützt sind. In Proben von Ndst1+/- Tieren wurden verringerte Mengen von ADAMTS und MMP spezifischen Aggrecan Neo-Epitopen sowie eine reduzierte Gelatinase-Aktivität festgestellt. Bei dem hier beschriebenen Projekt konnte eine herabgesetzte Gelatinase-Aktivität bestätigt und der Protease Mmp2 zugeordnet werden. Da die Expression von Mmp2 unverändert war, kann davon ausgegangen werden, dass die Aktivität der Protease auf Protein-Ebene reguliert wird. Zusätzlich zeigten vorläufige Ergebnisse außerdem eine erniedrigte Aktivität von Mmp9. Eine herabgesetzte Degradation des artikulären Knorpels durch eine geringere ProteaseAktivität ist daher wahrscheinlich einer der zugrundeliegenden Mechanismen, die den Schutz der Mausmutanten hervorrufen.

 

Die eingeschränkte Entwicklung von OA in Col2-rtTA-Cre;Ext1e2fl/e2fl, Col2- Cre;Ndst1fl/fl und Ndst1+/- Mäusen führte zu der Frage, ob andere Mausstämme mit veränderten Sulfatierungsmustern von Heparansulfaten (HS) ebenfalls vor OA geschützt sind und welche molekularen Mechanismen daran beteiligt sein könnten. Um diese Fragestellung zu beantworten wurden Glce+/- und Hs2st1+/- Mäuse sowie ihre Wildtyp-Geschwistertiere gealtert und im Alter von 6 Monaten und 18 Monaten auf das Auftreten von OA hin untersucht. In beiden Altersstufen konnte keine spontane Entwicklung von OA festgestellt werden. Die chirurgische Induktion von OA durch die Destabilisierung des medialen Meniskus zeigte, dass die Entwicklung von OA in Glce+/- und Hs2st1+/- Mäusen nicht beschleunigt ist. Durch die niedrigen OA Werte, die durch die Operation ausgelöst wurden, konnte ein protektiver Mechanismus jedoch nicht nachgewiesen werden.

 

Zusätzlich zum Schutz vor OA zeigen Col2-rtTA-Cre;Ext1e2fl/e2fl Tiere das Auftreten von gruppierten vergrößerten und morphologisch abgrenzbaren HS-defizienten Zellen im artikulären Knorpel. Diese Zellen sind umgeben von einer abweichend zusammengesetzten extrazellulären Matrix (ECM), die einen erhöhten Aggrecan Anteil enthält. Die Untersuchung der mechanischen Eigenschaften der Knorpelmatrix von Col2-rtTA-Cre;Ext1e2fl/e2fl Tieren durch Atomic Force Microscopy (AFM) zeigte, dass die Wildtyp-ähnliche Matrix der HS-synthetisierenden Zellen etwas fester war als bei Ext1e2fl/e2fl Mäusen. Die ECM der HS-defizienten Gruppen hatte jedoch eine stark veränderte Qualität außerhalb des Messbereichs. Um diese Einschränkung zu umgehen wurde eine Mausmutante mit einem hypomorphen Ext1- Allel analysiert. Der Wachstumsknorpel der Ext1gt/gt Mutante war im Vergleich zur Ext1+/+ Kontrolle weicher. Die veränderte Kompressionsfähigkeit des artikulären Knorpels könnte ein weiterer Mechanismus sein, der dem Schutz von Col2-rtTA-Cre;Ext1e2fl/e2fl Tieren vor OA zugrunde liegt.

 

Dies führt zu der Frage, wie die Chondrozyten ihre umgebende ECM wahrnehmen und wie sie auf Änderungen der Matrixkomposition reagieren. Vorläufige Ergebnisse wiesen darauf hin, dass FAK, pFAK, pERK and MHCII, Faktoren aus dem IntegrinSignalweg, in den HS-defizienten Zellen hochreguliert waren. Dies konnte durch Immunodetektion von weiteren Integrin-Signalweg Proteinen bestätigt werden. β1- Integrin, ERK und Src waren in den Gruppen mutanter Chondrozyten ebenfalls hoch exprimiert.

 

Um analysieren zu können, wie sich der Verlust der HS-Funktion auf zellbiologische Prozesse auswirkt, wurden primäre murine Fibroblasten (MEFs) mit dem HSAntagonisten Surfen behandelt. Dies zeigte eine verlangsamte Zelladhäsion zu frühen Zeitpunkten (0,5h, 1h, 2h), welche jedoch zu späteren Zeitpunkten (16h, 24h) von den Zellen ausgeglichen wurde. Life Cell Imaging Aufnahmen der frühen Adhäsionsphase zeigte in Anwesenheit von Surfen die Ausbildung dünner, Filopodien-artiger Membranfortsätze bei einem erhöhten Anteil von Zellen. Zusätzlich waren Migration und Polarisation der behandelten Zellen eingeschränkt und ein erhöhter Anteil von Zellen löste sich vom Untergrund ab. Die Visualisierung des Adaptor-Proteins Paxillin und des Aktin-Zytoskeletts zeigten nach 1h außerdem einen verringerten Anteil von Zellen, die Fokaladhäsionen (FA) oder Stressfasern (SF) gebildet hatten. Diese Veränderung konnte von den Zellen innerhalb von 24h ausgeglichen werden. Zusammengenommen weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass die durch den Verlust der HS-Funktion eingeschränkte Zelladhäsion durch einen kompensatorischen Mechanismus wiederhergestellt wird. Dies wird dadurch untermauert, dass das Hinzufügen von Surfen zu bereits adhärierten Zellen den Anteil von Zellen, die FA und SF ausbilden, ansteigen lässt. Dieser Effekt wird nicht durch Focal Adhesion Kinase (FAK) vermittelt, da Proteinmenge und Phosphorylierungsstatus in den behandelten Zellen unverändert waren. Die Zusammensetzung der ECM wird zusätzlich zu Integrin-abhängigen Prozessen auch durch andere Signalwege überwacht. Der Hippo-Signalweg ist für die Mechano-Rezeption von Adhäsionssubstraten bekannt und wird durch das intrazelluläre Protein YAP vermittelt. In mit Surfen behandelten MEFs wurde nach 1h sowie nach 24h eine in das Zytoplasma verlagerte Lokalisation von YAP festgestellt. Die Lokalisation des Proteins wurde jedoch nicht durch eine nachträgliche Zugabe von Surfen zu bereits adhärierten Zellen beeinflusst. Dies zeigt, dass die Translokation von YAP ins Zytoplasma abhängig vom Adhäsionsprozess geschah. Da der Phosphorylierungsstatus von YAP in den behandelten Zellen unverändert war, wurde die Verlegung von YAP ins Zytoplasma durch einen Phosphorylierungsunabhängigen Mechanismus kontrolliert.