Funktionelle Bedeutung der HopQ-vermittelten Bindung von Helicobacter pylori an lösliche und membrangebundene CEACAMs

Helicobacter pylori (H. pylori) ist ein gramnegatives Stäbchenbakterium, das die Mukosa des menschlichen Magens besiedelt. Über die Hälfte der Weltbevölkerung ist mit diesem Bakterium infiziert. Eine Infektion verläuft meist asymptomatisch, jedoch steigt das Risiko Gastritiden oder gastroduodenale Ulzera zu entwickeln. Aufgrund des Virulenzfaktors cytotoxin associated gene A (CagA), welches schlussendlich für diese malignen Neoplasien verantwortlich gemacht wird, wurde H. pylori bisherals einziges Bakterium von der WHO als Kanzerogen klassifiziert. Während der Kolonisierung bindet H. pylori mit zahlreichen Oberflächenmolekülen, wie dem SabA oder BabA an Zuckerstrukturen wie zum Beispiel dem Sialyl-Lewis X der Wirtszellen. Die Interaktion des Typ 4 Sekretionssystems (T4SS) an Integrine der Wirtszellen wurde bis vor kurzem als ausschlaggebender Faktor für eine erfolgreiche CagA Translokation angesehen. Vor kurzem wurden die karzinoembryonalen Antigen-assoziierten Zelladhäsionsmoleküle (CEACAMs), die zur Ig-Superfamilie gehören und auf zahlreichen Zelltypen exprimiert werden, als neuer Bindungspartner von H. pylori identifiziert. Das Bakterium bindet mit seinem Helicobacter outer membrane protein Q (HopQ) via Protein-Protein Interaktion an die N-Domäne verschiedener Mitglieder dieser Molekülfamilie. So werden CEACAM1, -3 und -5, nicht aber CEACAM8 gebunden. Die Bindung an CEACAM6 erfolgt laut den hier gezeigten Ergebnissen in Abhängigkeit des Glykosylierungsmusters von CEACAM6. Da der gesunde Magen physiologisch keine CEACAMs, aber als Folge einer starken Gastritis, eines Ulkus oder Karzinoms exprimiert, dient die HopQ-CEACAM Interaktion offensichtlich der Stressbesiedelung. In Kooperation konnten wir zeigen, dass die HopQ-CEACAM Interaktion und nicht aber wie ursprünglich angenommen die H. pylori-Integrin Bindung essenziell notwendig für eine CagA Translokation ist.

Im Rahmen dieser Arbeit wurde untersucht, ob die HopQ-CEACAM Interaktion weitere Funktionen der Wirtszellen beeinflusst. Hierzu wurde rekombinantes HopQ (rHopQ) verwendet, um dessen Einfluss auf Epithelzellen als isoliertes Protein unabhängig vom Bakterium zu charakterisieren. So wurde gezeigt, dass die Bindung von rHopQ an CEACAMs deren Expression und somit des eigenen Rezeptors in Abhängigkeit der Wachstumssituation der Zellen beeinflusst. Eine Bindung von rHopQ an CEACAMs in der proliferativen Wachstumssituation führte zu einer Hochregulation der CEACAM-Expression, während sie in der kontaktinhibierten Situation zu einer Herrunterregulation führte. Weiter wurde gezeigt, dass eine Bindung von rHopQ an CEACAMs von Magenkarzinomzellen das Migrationsverhalten dieser Zellen stark erhöhte. Die Interaktion von HopQ und CEACAMs macht H. pylori folglich unabhängig von dessen Virulenzfaktoren zusätzlich gefährlicher. Die Steigerung des Migrationspotenzials von Karzinomzellen führt zu einer erhöhten Metastasierung des Tumors, wodurch er aggressiver wird. Weitere Untersuchungen sollen hier Aufschluss über den Einfluss der HopQ-CEACAM Interaktion auf die Tumorprogression geben.

H. pylori besiedelt zwar primär den Magen, kann jedoch auch in den Darm übertreten. Der gesunde Darm exprimiert im Gegensatz zum Magen physiologisch CEACAM1, -5 und -6. Folglich könnte hier H. pylori an CEACAMs binden und so CagA in die Epithelzellen des Darms translozieren. Eine Korrelation zwischen H. pylori und malignen Neoplasien des Darms gibt es jedoch kaum. Den hier gezeigten Ergebnissen nach geben Epithelzellen CEACAMs auch in löslicher und EV-gebundener Form ab. Auf dieser Grundlage stellten wir die Hypothese auf, dass lösliche CEACAMs im Darm die HopQ vermittelte Interaktion von H. pylori mit membran-verankerten CEACAMs auf den Wirtszellen verhindert. Somit würden lösliche CEACAMs auch eine CagA Translokation unterbinden.

In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass lösliches CEACAM im Darm vorkommt und mit dem Stuhl ausgeschieden wird. Dabei werden CEACAM1, -5 und -6 von den Darmepithelzellen selbst abgegeben. Zudem enthält auch die Galle lösliches CEACAM1 und überraschenderweise auch lösliches CEACAM6. Diese gelangen  mit der Galle in das Duodenum. Mit rekombinantem CEACAM1- und CEACAM5-Fc konnte die Bindung von rHopQ an membrangebundenes CEACAM auf der Magenkarzinomzelllinie MKN-45 komplett blockiert werden. Nach einer Vorinkubation eines Gemischs aus löslichem CEACAM1, -5 und -6 und lebenden H. pylori konnte bei nachfolgender Inkubation mit MKN-45 Zellen keine Translokation des CagA in die Zellen nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse legen nahe, dass durch das lösliche CEACAM1 und -5 im Darm eine Bindung von H. pylori an das membrangebundene CEACAM des Darmepithels blockiert und die darauf folgende CagA Translokation inhibiert wird. Das Bakterium kann zwar trotzdem noch über andere Oberflächenproteine an das Epithel des Darms binden, jedoch findet durch die fehlende HopQ-CEACAM Interaktion keine CagA Translokation mehr statt. Hierdurch wird das onkogene Potenzial von H. pylori deutlich vermindert. Das lösliche CEACAM6-Fc spielt für die Blockierung keine Rolle, da es nicht mit HopQ interagiert. Es ist jedoch denkbar, dass es bei der Inhibition der Bindung von CEACAM6-bindenden Pathogenen, wie z. B. pathogenen E. coli Stämmen, an das Darmepithel eine Rolle spielen könnte. Der Mechanismus der Inhibition einer Interaktion von Bakterien an bestimmte Proteine der Epithelzellen durch lösliche CEACAMs wurde im Rahmen dieser Arbeit das erste Mal für H. pylori beschrieben. Es zeigt einen neuen, eleganten und effektiven Weg wie sich ein Wirt vor der Pathogenität CEACAM-bindender Bakterien schützt.

Helicobacter pylori (H. pylori) is a gram negative rod bacterium that colonizes the mucosa of the human stomach. More than half of the world population is infected with this bacterium. Infection is usually asymptomatic, but the risk of developing gastritis or gastroduodenal ulcers is increased. Due to the virulence factor cytotoxin associated gene A (CagA), which is ultimately responsible for malignant neoplasias, H. pylori is the only bacterium that has been classified as a carcinogen by the WHO. During colonization, H. pylori binds with numerous surface molecules, such as SabA or BabA, to sugar structures such as the sialyl-Lewis X of the host cells. Until recently, the interaction of the type 4 secretion system (T4SS) with integrins of the host cells was considered crucial factor for successful CagA translocation. However, carcinoembryonic antigen-associated cell adhesion molecules (CEACAMs), which are expressed on numerous cell types, have recently been identified as a new binding partner of H. pylori. The bacterium binds with its Helicobacter outer membrane protein Q (HopQ) via protein-protein interaction to the N-domain of various members of this molecule family. Thus CEACAM1, -3 and -5, but not CEACAM8 are bound. According to the results shown here, binding to CEACAM6 is dependent on the glycosylation pattern of CEACAM6. Since the healthy stomach physiologically does not express CEACAMs but as a consequence of severe gastritis, ulcer or carcinoma, the HopQ-CEACAM interaction obviously serves as a stress colonization. In cooperation we could show that the HopQ-CEACAM interaction and not the H. pylori integrin binding as originally assumed is essential for CagA translocation.

The aim of this thesis was to investigate whether the HopQ-CEACAM interaction influences further host cell functions. For this purpose, recombinant HopQ (rHopQ) was used to characterize its influence on epithelial cells as an isolated protein independent of the bacterium. It was shown that the binding of rHopQ to CEACAMs influences their expression and thus their own receptor depending on the growth situation of the cells. Binding of rHopQ to CEACAMs in the proliferative growth situation led to an up-regulation of CEACAM expression, whereas binding in the contact-inhibited situation led to a down-regulation. Furthermore, it was shown that binding of rHopQ to CEACAMs expressed on gastric cancer cells strongly increased the migration behavior of these cells. Consequently, the interaction of HopQ and CEACAMs makes H. pylori even more dangerous regardless of its virulence factors. The increase in the migration potential of carcinoma cells leads to increased metastasis of the tumor, making it more aggressive. Further investigations will provide information on the influence of the HopQ-CEACAM interaction on tumor progression.

Although H. pylori colonizes primarily the stomach, it can also enter the intestine. The healthy intestine, in contrast to the stomach, physiologically expresses CEACAM1, -5 and -6, so Consequently, H. pylori could also bind to CEACAMs and thus translocate CagA into these epithelial cells. However, there is hardly any correlation between H. pylori and malignant neoplasias of the intestine. According to the data shown here, epithelial cells also release CEACAMs in soluble and EV-bound form. On this basis we hypothesized that soluble CEACAMs in the intestine prevent the HopQ-mediated interaction of H. pylori with membrane-bound CEACAMs on host cells. Thus, soluble CEACAMs would also prevent CagA translocation.

In this work it could be shown that soluble CEACAM occurs in the intestine and is excreted with the stool. CEACAM1, -5 and -6 are released by the intestinal epithelial cells themselves. In addition, bile also contains soluble CEACAM1 and, surprisingly, also soluble CEACAM6. These enter the duodenum with the bile. With recombinant CEACAM1- and CEACAM5-Fc the binding of rHopQ to membrane-bound CEACAM could be completely blocked on the gastric cancer cell line MKN-45. After pre-incubation of a mixture of soluble CEACAM1, -5 and -6 and live H. pylori, no translocation of CagA into the cells could be detected when subsequently incubated with MKN-45 cells. These results suggest that the soluble CEACAM1 and -5 in the intestine blocks the binding of H. pylori to the membrane-bound CEACAM of the intestinal epithelium and inhibits the subsequent CagA translocation. Although the bacterium can still bind to the intestinal epithelium via other surface proteins, the missing HopQ-CEACAM interaction prevents CagA translocation. This significantly reduces the oncogenic potential of H. pylori. The soluble CEACAM6 does not play a role in blocking, as it does not interact with HopQ. However, it is conceivable that it could play a role in inhibiting the binding of CEACAM6-binding pathogens, such as pathogenic E. coli strains, to the intestinal epithelium.

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Schmitt, V., 2021. Funktionelle Bedeutung der HopQ-vermittelten Bindung von Helicobacter pylori an lösliche und membrangebundene CEACAMs. https://doi.org/10.17185/duepublico/74015
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