Targeting transcriptional regulators for the treatment of therapy resistant carcinomas

1) Das duktale Adenokarzinom des Pankreas (engl. PDAC) ist eines der therapieresistentesten Karzinome. Frühere Studien zeigten, dass die kombinierte Behandlung mit BET und HDAC Inhibitoren zu Synergien in verschiedenen Tumorarten, inklusive PDAC, führt. Toxizität, Inhibitor-Interaktionen oder Probleme mit der Pharmakokinetik limitieren den Einsatz von Kombinationstherapien für gewöhnlich. Das Ziel dieser Arbeit war es, einen neuartigen dualen BET/HDAC Inhibitor zu designen und seine Wirksamkeit zu testen um die Vorteile einer Kombinationstherapie in einem Molekül zu vereinen.

In Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Herrn Prof. Dr. Stefan Knapp (Goethe Universität, Frankfurt), wurden drei Inhibitoren, bestehend aus den Grundgerüsten von JQ1 als BET Inhibitor und SAHA, Panobinostat und CI994 als HDAC Inhibitoren, synthetisiert und getestet. Basierend auf Ergebnissen aus zellularen Assay-Systemen, wurde TW9, die Kombination aus JQ1 und CI994, als potentester Dual-inhibitor ausgewählt und weiter charakterisiert. Es zeigte sich, dass TW9 sowohl BETi- als auch HDACi-Aktivitäten in sich vereint, vergleichbar zu den einzelnen Substanzen. Zusätzlich konnten washout-Experimente zeigen, dass TW9 im direkten Vergleich zu CI994 eine verstärkte Acetylierung von Histonen bewirkt. Es wurde bereits vorher veranschaulicht, dass eine Behandlung mit JQ1 im NUT midline carcinoma (NMC), einem undifferenzierten Plattenepithelkarzinom, Differenzierung induzieren kann. Behandlungen mit TW9 wiesen eine wesentlich effizientere differentielle Induktion von Plattenepithelgewebe-Genen wie KRT10, KRT14 oder TGM1 auf. Cell viability assays in verschiedenen PDAC Zelllinien verdeutlichten einen ausgeprägteren anti-proliferativen Effekt von TW9 im Vergleich zu den Einzelinhibitoren oder deren Kombination. Immunoblot-Analysen deuten zusätzlich eine starke Induktion von Apoptose in TW9-behandelten Zellen an. Bemerkenswerterweise wies TW9 in Kurzzeitexperimenten ebenfalls eine verlängerte und ausgeprägte anti-proliferative Wirkung auf. Zusätzlich wurde eine Kombinationstherapie mit Gemcitabine, dem Standard-Chemotherapeutikum für PDAC, getestet. Dabei zeigte sich, dass eine sequentielle Verabreichung von TW9 und Gemcitabine synergistische Effekte aufwies und Apoptose deutlich stärke induzierte als Gemcitabine alleine. Des Weiteren wurde verdeutlicht, dass phospho-CHK1, ein Indikator für durch Gemcitabine induzierten replikativen Stress, nach sequentieller Verabreichung verstärkt nachweisbar war. Simultane Verabreichung hingegen schützte die Zellen weitestgehend vor replikativem Stress. TW9, wie auch JQ1, sorgt für eine Anreicherung von Zellzyklusregulator p21, was die Zellen in der G1 Phase festsetzt und verhindert, dass Gemcitabine in die DNA eingebaut wird. Um mehr über den molekularen Mechanismus hinter TW9 zu erfahren, wurde ein Transkriptom-Profil erstellt. Es zeigte sich, dass TW9 zum großen Teil Effekte von JQ1 und CI994 in sich vereint und hauptsächlich mit metabolischen und Zellzyklus-Prozessen in Verbindung gebracht werden kann. Das Ziel war es TW9-spezifische master-Transkriptionsfaktoren zu identifizieren, die den Zellzyklus regulieren und zusätzlich durch super-enhancers (SEs)angetrieben werden. Insgesamt wurden 453 SEs ermittelt, von denen 12 exklusiv on TW9 beeinfluss werden. Die Auswertung ergab, dass die Runterregulierung von Transkriptionsfaktor FOSL1 durch TW9 möglicherweise für die starke anti-proliferative Wirkung mitverantwortlich ist. FOSL1 dient zusätzlich als prognostischer Marker und hohe Expressionslevel werden mit einer geringeren Überlebensrate von Patienten in Verbindung gebracht.

Zusammenfassend wurde die Synthese und Charakterisierung eines neuartigen dualen BET/HDAC-Inhibitors beschrieben, der eine vielversprechende anti-Tumorwirkung aufweist und dessen molekulare Mechanismen genauer beleuchtet wurden.

2)

NUT midline carcinoma (NMC), ist ein seltenes, aber auch sehr aggressives und therapieresistentes, undifferenziertes Plattenepithelkarzinom. Charakteristisch für NMC ist eine chromosomale Umlagerung des NUT-Gens, zumeist an das bromodomain and extraterminal domain (BET)-Gen BRD4, was zur Bildung eines BRD4-NUT-Fusionsonkogens führt. Durch die Beteiligung von BRD4, repräsentieren BET-Inhibitoren einen attraktiven Behandlungsansatz. Da allerdings Toxizität und aufkommende Resistenzen, die in klinischen Studien beobachtet wurden, den Einsatz von BET-Inhibitoren einschränken, war das Ziel dieser Arbeit die Identifizierung neuer selektiver Inhibitoren für die Behandlung von NCM.

Es wurde ein drug screening mit einer Sammlung verschiedener compounds, welche sowohl aus der Industrie als auch von akademischen Kooperationspartner stammen und vom Structural Genomics Consortium (SGC) zusammengestellt wurden, durchgeführt. Neben dem bekannten BET-Inhibitor JQ1 wurde der HAT-Inhibitor A485 identifiziert und weiter charakterisiert. Im Gegensatz zu JQ1 war A485 ausschließlich in NMC Zellen aktiv, im direkten Vergleich mit anderen Zelllinien. Gleichzeitig zeigte ein inaktiven Kontrollcompound A486 zeigte keinerlei Aktivität in NMC Zellen. Immunofluoreszens- und Immunoblot-Analysen veranschaulichten, dass BRD4-NUT sowie BRD4 Wildtyp co-lokalisiert mit acetyliertem H3K27 waren und nach einer Behandlung mit A485 verschwanden bzw. zerstreut wurden. Das Binden von BRD4-NUT an acetyliertes Histon führt zur Interaktion mit und Rekrutierung von p300/CBP, wodurch umliegende Histone weiter acetyliert werden, was wiederum BRD4-NUT rekrutiert und in einem sich Selbs verstärkenden Schleifenmechanismus endet. Riesige acetylierte Megadomänen innerhalb des Chromatins werden auf diese Weise gebildet. Es konnte gezeigt werden, dass eine Behandlung mit A485 die Bildung dieser Megadomänen unterbindet, die durch NUT-BRD4 induziert werden. Des Weiteren wurde beobachtet, dass Gene, welche in direktem Zusammenhang mit diesen Megadomänen stehen, wie MYC, CCAT1 oder TP63, ebenfalls runterreguliert wurden. Mit Hilfe von Chromatin-Immunopräzipitation wurden zusätzlich verringerte Mengen von acetyliertem Histon und BRD4-NUT am MYC-Promoter bzw. am TP63-enhancer in mit A485 behandelten Zellen nachgewiesen. Ein loss-of-function- Experiment bestätigte, dass in Zellen mit einem p300/CBP Doppel-knockdown ebenfalls MYC, CCAT1 und TP63 runterreguliert wurden. Es konnte gezeigt werden, dass eine A485-Behandlung einen differenzierten Phänotyp auslöste, der erhöhte Mengen pan-Cytokeratin im Cytoplasma aufwies. Die drei Plattenepithelgewebe-Gene KRT10, KRT14 und TGM1 wurden genau wie der Transkriptionsfaktor für epitheliale Zelldifferenzierung c-fos hochreguliert. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass A485 zu einem frühen Zeitpunkt (24h) eine Blockade der G1-Phase auslöst und zu einem späteren Zeitpunkt (48h und 72h) Apoptose in NMC Zellen induziert. Zusätzlich wurden synergistische, anti-proliferative Effekte zwischen JQ1 und A495 beobachtet, woraufhin ein Transkriptom-Profil erstellt wurde, um den molekularen Mechanismus genauer zu beleuchten. Es zeigte sich, dass die kombinierte Behandlung mit beiden Inhibitoren deutlich mehr Gene beeinflusste als die Behandlung mit beiden Einzelinhibitoren zusammen. Zu den am stärksten beeinflussten Signalwegen gehörten der P53- als auch Wnt/ß-catenin-Signalweg sowie Signalwege, die mit Apoptose in Verbindung gebracht werden. Zusätzlich wurde gezeigt, dass mit geringeren Behandlungskonzentrationen nur die kombinierte Behandlung mit beiden Inhibitoren Zelldifferenzierung auslösen konnte.

Zusammenfassend konnte die p300/CBP HAT-Domäne als neue, therapeutische Zielstruktur in NMC identifiziert werden. Die Ergebnisse verdeutlichen, dass der HAT-Inhibitor A485 die Bildung von hyperacetylierten Megadomänen unterbindet und in der Lage ist Differenzierung und Apoptose zu induzieren. Eine Kombinationstherapie mit BET-Inhibitoren könnte ebenfalls eine Möglichkeit bieten, Therapieresistenzen gegen eben diese zu adressieren.

1) Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is one of the most therapy resistant tumors. Previous studies showed that combined BET and HDAC inhibition is synergistic in tumor models of various malignancies including PDAC. However, toxicity, drug-drug interactions or pharmacokinetics can limit the application of combination therapies. The aim of this study was to design and analyze the efficacy of a novel dual BET/HDAC inhibitor to combine the benefits of a combinational approach in one single molecule.

In cooperation with the group of Prof. Dr. Stefan Knapp (Goethe Universität, Frankfurt), three small molecules, containing the backbone of JQ1 as BET inhibitor and SAHA, Panobinostat or CI994 as HDAC inhibitor, were synthesized and tested. Based on cellular activity assays, TW9, the combination of JQ1 and CI994, was chosen as most potent BET/HDAC inhibitor for further characterizations. TW9 preserves both BETi and HDACi activities in cancer cells, comparable to single drug treatment. Additionally, washout experiments could demonstrate an enhanced histone acetylation for TW9-treated samples, in contrast to CI994 alone. In NUT midline carcinoma (NMC), a poorly differentiated squamous cell carcinoma, previous study showed that inhibition by JQ1 was able to induce squamous differentiation. Treatment with TW9 was significantly more efficient than JQ1 in inducing canonical squamous tissue genes like KRT10, KRT14 or TGM1 and induced morphological changes. Cell viability assays in different PDAC cell lines showed more pronounced anti-proliferative effects for TW9 compared to JQ1, CI994 or the combination of both inhibitors. Immunoblot analysis also indicated a stronger induction of apoptosis by TW9. Notably, a prolonged suppression of proliferation by TW9 compared to single inhibitor or combinational treatment was observed, using short-time treatment. The combinational efficacy of TW9 and gemcitabine, the standard-of-care chemotherapeutic agent in the treatment of PDAC, was also evaluated. Sequential administration of gemcitabine and TW9 showed synergistic antitumor effects and strong induction of apoptosis compared to gemcitabine alone. Further, phospho-CHK1, an indicator for replicative stress induced by gemcitabine, was enhanced after sequential treatment. Simultaneous treatment largely prevented cells from replicative stress. TW9 was shown, just like JQ1, to induced accumulation of the cell-cycle regulator p21, which led to G1 arrest and to decrease the incorporation into DNA by gemcitabine. To explore more about the molecular mechanisms of TW9, transcriptomic profiling was performed. TW9 largely recapitulated the activity of JQ1 and CI994 and was mainly associated with metabolic processes, cellular component organization and cell cycle-related processes. The aim was to identify TW9-downregulated master transcriptional regulators that control cell cycle progression and are driven by super-enhancers. 453 super-enhancers were identified by ChIP-seq and 12 super-enhancers-associated genes were identified to be TW9-specific. The analysis revealed that downregulation of transcription factor FOSL1 may contribute to the antitumor effects of TW9, since FOSL1 is a prognostic marker and high expression levels are unfavorable for patient survival.

In summary, we reported on the generation and characterization of a novel dual BET/HDAC inhibitor with promising anti-tumor properties in PDAC and revealed insights regarding molecular mechanisms.

2) NUT midline carcinoma (NMC), is a rare but highly aggressive and therapy resistant form of undifferentiated squamous cell carcinoma. Its characterized by chromosomal rearrangement of the NUT gene, most commonly to the bromodomain and extraterminal domain (BET) gene BRD4, forming a BRD4-NUT fusion oncogene. Because of the involvement of BRD4, BET inhibitors represent an attractive therapeutic approach. Since toxicity and obtained resistance observed in clinical trials limit the use BET inhibitors, the aim was to identify new selective compounds for the treatment of NMC.

A drug screening approach using a library of different compounds developed by industry and academic collaborators and collected by the Structural Genomics Consortium (SGC) was performed. P300/CBP HAT inhibitor A-485, as well as the known BET inhibitor JQ1, was identified and further characterized. In contrast to JQ1, A-485 was selectively potent in NMC compared to other cell lines tested. Supporting an on-target action of A-485, an inactive analogue A-486 yielded no activity in NMC cells. Immunofluorescence and immunoblot analysis revealed that BRD4-NUT and BRD4 expressed from wild-type allele (BRD4 wt) were co-localized with acetylated H3K27 and decreased and dispersed after treatment with A485. The binding of BRD4-NUT to acetylated histones leads to interaction and recruitment of p300/CBP, which further acetylate histones and recruit even more BRD4-NUT in a feed-forward manner. Large acetylated chromatin regions termed megadomains are created. It was shown, that A485 impairs the formation of hyperacetylated megadomains, induced by binding of BRD4-NUT and recruitment of p300. Further, megadomain-associated genes like MYC, CCAT1 and TP63 were also downregulated. Chromatin immunoprecipitation revealed diminished H3K27ac and BRD4-NUT levels at the MYC promoter and TP63 enhancer regions in A-485-treated cells. Additionally, a loss-of-function experiment was performed and in agreement with A-485 treatment, double knockdown of p300 and CBP also downregulated MYC, CCAT1 and TP63 mRNA levels. It was shown that treatment with A-485 induces a differentiated phenotype and increased levels of pan-cytokeratin in cytoplasm. The three canonical squamous tissue genes KRT10, KRT14 and TGM1 were upregulated as well as C-fos, a transcription factor required for normal epithelial cell differentiation. Further, it was shown, that A-485 induced G1 arrest in NMC cells at early time point (24 h) and apoptosis at later time points (48 h and 72 h). In Addition, strong synergistic anti-proliferative effects between JQ1 and A485 were observed and transcriptomic profiling was performed to explore the molecular mechanism. Combined treatment differentially regulated significantly more genes than both single treatments together. The most significantly enriched pathways are the p53 pathway, apoptosis and Wnt/β catenin signaling pathway. Additionally, using low dose concentrations, only combined treatment induced squamous differentiation in contrast to single drug treatment.

In summary, p300/CBP HAT domain was identified as a novel potential therapeutic target for the treatment of therapy resistant NMC. The findings indicate that p300/CBP inhibition by A-485 efficiently impairs BRD4-NUT oncogenic functions in NMC megadomains and induces differentiation and apoptosis. Combined p300/CBP and BET inhibition may be a potential approach to overcame obtained resistance to BET inhibitors.

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Zegar, T., 2021. Targeting transcriptional regulators for the treatment of therapy resistant carcinomas. https://doi.org/10.17185/duepublico/74002
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