1) Das duktale Adenokarzinom des Pankreas (engl. PDAC) ist eines der therapieresistentesten Karzinome. Frühere Studien zeigten, dass die kombinierte Behandlung mit BET und HDAC Inhibitoren zu Synergien in verschiedenen Tumorarten, inklusive PDAC, führt. Toxizität, Inhibitor-Interaktionen oder Probleme mit der Pharmakokinetik limitieren den Einsatz von Kombinationstherapien für gewöhnlich. Das Ziel dieser Arbeit war es, einen neuartigen dualen BET/HDAC Inhibitor zu designen und seine Wirksamkeit zu testen um die Vorteile einer Kombinationstherapie in einem Molekül zu vereinen.

In Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Herrn Prof. Dr. Stefan Knapp (Goethe Universität, Frankfurt), wurden drei Inhibitoren, bestehend aus den Grundgerüsten von JQ1 als BET Inhibitor und SAHA, Panobinostat und CI994 als HDAC Inhibitoren, synthetisiert und getestet. Basierend auf Ergebnissen aus zellularen Assay-Systemen, wurde TW9, die Kombination aus JQ1 und CI994, als potentester Dual-inhibitor ausgewählt und weiter charakterisiert. Es zeigte sich, dass TW9 sowohl BETi- als auch HDACi-Aktivitäten in sich vereint, vergleichbar zu den einzelnen Substanzen. Zusätzlich konnten washout-Experimente zeigen, dass TW9 im direkten Vergleich zu CI994 eine verstärkte Acetylierung von Histonen bewirkt. Es wurde bereits vorher veranschaulicht, dass eine Behandlung mit JQ1 im NUT midline carcinoma (NMC), einem undifferenzierten Plattenepithelkarzinom, Differenzierung induzieren kann. Behandlungen mit TW9 wiesen eine wesentlich effizientere differentielle Induktion von Plattenepithelgewebe-Genen wie KRT10, KRT14 oder TGM1 auf. Cell viability assays in verschiedenen PDAC Zelllinien verdeutlichten einen ausgeprägteren anti-proliferativen Effekt von TW9 im Vergleich zu den Einzelinhibitoren oder deren Kombination. Immunoblot-Analysen deuten zusätzlich eine starke Induktion von Apoptose in TW9-behandelten Zellen an. Bemerkenswerterweise wies TW9 in Kurzzeitexperimenten ebenfalls eine verlängerte und ausgeprägte anti-proliferative Wirkung auf. Zusätzlich wurde eine Kombinationstherapie mit Gemcitabine, dem Standard-Chemotherapeutikum für PDAC, getestet. Dabei zeigte sich, dass eine sequentielle Verabreichung von TW9 und Gemcitabine synergistische Effekte aufwies und Apoptose deutlich stärke induzierte als Gemcitabine alleine. Des Weiteren wurde verdeutlicht, dass phospho-CHK1, ein Indikator für durch Gemcitabine induzierten replikativen Stress, nach sequentieller Verabreichung verstärkt nachweisbar war. Simultane Verabreichung hingegen schützte die Zellen weitestgehend vor replikativem Stress. TW9, wie auch JQ1, sorgt für eine Anreicherung von Zellzyklusregulator p21, was die Zellen in der G1 Phase festsetzt und verhindert, dass Gemcitabine in die DNA eingebaut wird. Um mehr über den molekularen Mechanismus hinter TW9 zu erfahren, wurde ein Transkriptom-Profil erstellt. Es zeigte sich, dass TW9 zum großen Teil Effekte von JQ1 und CI994 in sich vereint und hauptsächlich mit metabolischen und Zellzyklus-Prozessen in Verbindung gebracht werden kann. Das Ziel war es TW9-spezifische master-Transkriptionsfaktoren zu identifizieren, die den Zellzyklus regulieren und zusätzlich durch super-enhancers (SEs)angetrieben werden. Insgesamt wurden 453 SEs ermittelt, von denen 12 exklusiv on TW9 beeinfluss werden. Die Auswertung ergab, dass die Runterregulierung von Transkriptionsfaktor FOSL1 durch TW9 möglicherweise für die starke anti-proliferative Wirkung mitverantwortlich ist. FOSL1 dient zusätzlich als prognostischer Marker und hohe Expressionslevel werden mit einer geringeren Überlebensrate von Patienten in Verbindung gebracht.

Zusammenfassend wurde die Synthese und Charakterisierung eines neuartigen dualen BET/HDAC-Inhibitors beschrieben, der eine vielversprechende anti-Tumorwirkung aufweist und dessen molekulare Mechanismen genauer beleuchtet wurden.

2)

NUT midline carcinoma (NMC), ist ein seltenes, aber auch sehr aggressives und therapieresistentes, undifferenziertes Plattenepithelkarzinom. Charakteristisch für NMC ist eine chromosomale Umlagerung des NUT-Gens, zumeist an das bromodomain and extraterminal domain (BET)-Gen BRD4, was zur Bildung eines BRD4-NUT-Fusionsonkogens führt. Durch die Beteiligung von BRD4, repräsentieren BET-Inhibitoren einen attraktiven Behandlungsansatz. Da allerdings Toxizität und aufkommende Resistenzen, die in klinischen Studien beobachtet wurden, den Einsatz von BET-Inhibitoren einschränken, war das Ziel dieser Arbeit die Identifizierung neuer selektiver Inhibitoren für die Behandlung von NCM.

Es wurde ein drug screening mit einer Sammlung verschiedener compounds, welche sowohl aus der Industrie als auch von akademischen Kooperationspartner stammen und vom Structural Genomics Consortium (SGC) zusammengestellt wurden, durchgeführt. Neben dem bekannten BET-Inhibitor JQ1 wurde der HAT-Inhibitor A485 identifiziert und weiter charakterisiert. Im Gegensatz zu JQ1 war A485 ausschließlich in NMC Zellen aktiv, im direkten Vergleich mit anderen Zelllinien. Gleichzeitig zeigte ein inaktiven Kontrollcompound A486 zeigte keinerlei Aktivität in NMC Zellen. Immunofluoreszens- und Immunoblot-Analysen veranschaulichten, dass BRD4-NUT sowie BRD4 Wildtyp co-lokalisiert mit acetyliertem H3K27 waren und nach einer Behandlung mit A485 verschwanden bzw. zerstreut wurden. Das Binden von BRD4-NUT an acetyliertes Histon führt zur Interaktion mit und Rekrutierung von p300/CBP, wodurch umliegende Histone weiter acetyliert werden, was wiederum BRD4-NUT rekrutiert und in einem sich Selbs verstärkenden Schleifenmechanismus endet. Riesige acetylierte Megadomänen innerhalb des Chromatins werden auf diese Weise gebildet. Es konnte gezeigt werden, dass eine Behandlung mit A485 die Bildung dieser Megadomänen unterbindet, die durch NUT-BRD4 induziert werden. Des Weiteren wurde beobachtet, dass Gene, welche in direktem Zusammenhang mit diesen Megadomänen stehen, wie MYC, CCAT1 oder TP63, ebenfalls runterreguliert wurden. Mit Hilfe von Chromatin-Immunopräzipitation wurden zusätzlich verringerte Mengen von acetyliertem Histon und BRD4-NUT am MYC-Promoter bzw. am TP63-enhancer in mit A485 behandelten Zellen nachgewiesen. Ein loss-of-function- Experiment bestätigte, dass in Zellen mit einem p300/CBP Doppel-knockdown ebenfalls MYC, CCAT1 und TP63 runterreguliert wurden. Es konnte gezeigt werden, dass eine A485-Behandlung einen differenzierten Phänotyp auslöste, der erhöhte Mengen pan-Cytokeratin im Cytoplasma aufwies. Die drei Plattenepithelgewebe-Gene KRT10, KRT14 und TGM1 wurden genau wie der Transkriptionsfaktor für epitheliale Zelldifferenzierung c-fos hochreguliert. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass A485 zu einem frühen Zeitpunkt (24h) eine Blockade der G1-Phase auslöst und zu einem späteren Zeitpunkt (48h und 72h) Apoptose in NMC Zellen induziert. Zusätzlich wurden synergistische, anti-proliferative Effekte zwischen JQ1 und A495 beobachtet, woraufhin ein Transkriptom-Profil erstellt wurde, um den molekularen Mechanismus genauer zu beleuchten. Es zeigte sich, dass die kombinierte Behandlung mit beiden Inhibitoren deutlich mehr Gene beeinflusste als die Behandlung mit beiden Einzelinhibitoren zusammen. Zu den am stärksten beeinflussten Signalwegen gehörten der P53- als auch Wnt/ß-catenin-Signalweg sowie Signalwege, die mit Apoptose in Verbindung gebracht werden. Zusätzlich wurde gezeigt, dass mit geringeren Behandlungskonzentrationen nur die kombinierte Behandlung mit beiden Inhibitoren Zelldifferenzierung auslösen konnte.

Zusammenfassend konnte die p300/CBP HAT-Domäne als neue, therapeutische Zielstruktur in NMC identifiziert werden. Die Ergebnisse verdeutlichen, dass der HAT-Inhibitor A485 die Bildung von hyperacetylierten Megadomänen unterbindet und in der Lage ist Differenzierung und Apoptose zu induzieren. Eine Kombinationstherapie mit BET-Inhibitoren könnte ebenfalls eine Möglichkeit bieten, Therapieresistenzen gegen eben diese zu adressieren.