Reconstitution and characterization of kinetochore units assembled on centromeric nucleosome templates
Kinetochores, large multi-protein assemblies on centromeric DNA, interact with spindle microtubules to mediate faithful chromosome segregation during mitosis. The inner part of the kinetochore, the 16-subunit constitutive centromere associated network (CCAN), flanks the centromere throughout the cell cycle and provides the structural foundation for the peripheral kinetochore subunits. Centromere protein (CENP)-C is a fundamental CCAN subunit that provides a foundation, either directly or indirectly, to all other kinetochore components onto the specialized centromeric chromatin. Recent biochemical reconstitution studies provided insights into the complex human kinetochore architecture but still lacked the full-length version of CENP-C. My PhD work aimed to characterize the interactions of recombinant full-length CENP-C with nucleosomes and the other kinetochore members in vitro. Furthermore, my work aimed to define the determinants for the centromere recruitment of CENP-C. Lastly, in my studies, I gained new insights into the propagation of centromeric chromatin.
Combining biochemical reconstitution and biophysical methods, I revealed that the full-length CENP-C protein binds two nucleosomes and that this interaction strictly depends on two conserved nucleosome binding motifs. Using dinucleosomes bound to full-length CENP-C as a template, a 30-subunit kinetochore particle was reconstituted containing all inner and outer kinetochore subcomplexes. Electroporation of CENP-C into living human cells showed that CENP-C depends on the interactions with nucleosomes and with the CCAN members CENP-HIKM/-LN for its proper recruitment to the centromere. Furthermore, homo-dimerization mediated by the Cupin-like domain was identified as a mechanism promoting affinity towards the centromere. Immunoprecipitation experiments from cell lysates combined with mass spectrometry analysis identified Polo-like kinase 1 (PLK1) as a crucial factor that promotes centromere propagation.
In conclusion, this work demonstrates that CENP-C can bridge two adjacent nucleosomes and suggests that the resulting dinucleosome structure might represent the fundamental unit of the human kinetochore. This structure furthermore provides the basis for the in vitro reconstitution of the entire inner and outer kinetochore by integrating the CENP-C and CENP-T dependent pathway.
Kinetochore stellen Multi-Proteinkomplexe dar, die sich am Zentromer anlagern und während der Mitose die korrekte Aufteilung der Chromosomen bewerkstelligen, indem sie als Ankerpunkte für die Fasern des Spindelapparates dienen. Das innere Kinetochor, auch "Constitutive Centromere Associated Network" (CCAN) genannt, das aus 16 Untereinheiten besteht, flankiert das Zentromer während des gesamten Zellzyklus und bildet zudem die strukturelle Plattform für die äußeren Kinetochorproteine. Das "Centromere Protein (CENP)-C" stellt eine wichtige CCAN- Untereinheit dar und beinhaltet zwei benachbarte nukleosomenbindende Motive, darüber hinaus rekrutiert es entweder direkt oder indirekt alle weiteren Kinetochorproteine. Aktuelle biochemische Studien, die das Kinetochor in vitro nachbilden, liefern Einblicke in die komplexe Architektur des menschlichen Kinetochors, beinhalten aber nicht das vollständige CENP-C-Protein. Das Ziel meiner Doktorarbeit war, erstmals die Interaktion zwischen dem aufgereinigten, vollständigen CENP-C-Protein und Nukleosomen sowie den anderen Kinetochorproteinen in vitro zu charakterisieren. Außerdem sollte untersucht werden, wie genau CENP-C an das Zentromer rekrutiert wird. Darüber hinaus liefert meine Arbeit einen Einblick, wie das Zentromer-Chromatin in Zellen erhalten bleibt.
Durch biochemische Rekonstitution konnte ich unter Anwendung biophysikalischer Methoden zeigen, dass das vollständige CENP-C-Protein mit zwei Nukleosomen interagiert und dass diese Interaktion von der Intaktheit der beiden CENP-C-Motive abhängt. Ein Komplex aus CENP-C und Dinukleosomen diente des Weiteren als Grundlage für die Rekonstitution von Kinetochorpartikeln, die mit insgesamt 30 Untereinheiten sämtliche Teilkomplexe des inneren sowie äußeren Kinetochors enthalten. Die Elektroporation von CENP-C in lebende menschliche Zellen zeigte, dass CENP-C sowohl mit Nukleosomen als auch mit den CCAN-Untereinheiten CENP-HIKM/-LN interagieren muss, um zuverlässig an das Zentromer rekrutiert zu werden. Außerdem zeigte sich, dass die Homo-Dimerisierung der "Cupin"-Domäne die Affinität von CENP-C zum Zentromer erhöht. Zuletzt konnte die massenspektroskopische Analyse von Immunpräzipitationen aus Zelllysaten Polo-like Kinase 1 (PLK1) als bedeutenden Faktor identifizieren, der für die Konservierung des Zentromerchromatins benötigt wird.
Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass zwei benachbarte Nukleosomen von CENP-C überbrückt werden und dass die resultierende Dinukleosomenstruktur die fundamentale Einheit des humanen Kinetochors repräsentieren könnte. Darüber hinaus dient diese Struktur als Grundgerüst für die in vitro-Rekonstitution des gesamten inneren und äußeren Kinetochors, was durch die Integration sowohl von CENP-C als auch von CENP-T ermöglicht wird.