Die Anbindung von Epitop-spezifischen Peptiden an ultrakleine Goldnanopartikel

In der vorliegenden Arbeit konnten erste Einblicke in das Wechselwirkungsverhalten von spezifisch funktionalisierten ultrakleinen Goldnanopartikeln mit Proteinen erhalten werden. Im Fokus standen dabei sowohl die spezifische Funktionalisierung der Nanopartikel-Oberfläche als auch die Aufklärung ihrer Struktur und Beladungskapazität. Darauf aufbauend konnte die Wechselwirkung der Goldnanopartikel mit Proteinen untersucht und ein Protein-zu-Nanopartikel-Verhältnis abgeschätzt werden.

Für derartige Untersuchungen eignet sich aufgrund der Größe der Goldnanopartikel insbesondere die NMR-Spektroskopie, aber auch Methoden wie Isothermer Titrationskalorimetrie (ITC) und Fluoreszenzpolarisation wurden unterstützend verwendet.

Ausgangspunkt war die wässrige Synthese von ultrakleinen Goldnanopartikeln mit direkter Oberflächenfunktionalisierung mit der Aminosäure L‑Cystein nach der Methode von Schütze et al. Über die Thiol-Gruppe des L‑Cysteins wird eine stabile, polar-kovalente Bindung mit der Goldnanopartikel-Oberfläche ausgebildet. Weiterführend kann L‑Cystein (als Bestandteil von Peptiden und Proteinen) als Bindungsbaustein für die Anbindung spezifischer Liganden fungieren, die wiederum eine spezifische Wechselwirkung mit Protein-Epitopen eingehen können.

Begonnen wurde mit der Charakterisierung der Größe und der chemischen Struktur von Goldnanopartikeln, funktionalisiert mit unmarkiertem L‑Cystein. Der Fokus lag hier auf dem Bindungsverhalten des Moleküls an der Nanopartikel-Oberfläche.

Die chemische Struktur der hergestellten Goldnanopartikel bzw. die Anbindung des Liganden an die Oberfläche wurden zunächst mittels eindimensionaler und zweidimensionaler NMR-Spektroskopie untersucht. Damit konnte ein erster Hinweis auf eine erfolgreiche Anbindung des Liganden erhalten werden. Das 1H-NMR-Spektrum der funktionalisierten Goldnanopartikel zeigt tieffeldverschobene, mehrfach aufgespaltene und verbreiterte Signale im Vergleich zum 1H-NMR-Spektrum des ungebundenenL‑Cysteins. An dieser Stelle war eine genaue Signalzuordnung im 1H-NMR-Spektrum nicht möglich. Auch eine Zuordnung mittels zweidimensionaler NMR-Spektroskopie (1H-1H-COSY) stellte sich als schwierig heraus. Die mehrfach aufgespaltenen Signale zeigen dort ein komplexes Kopplungsmuster, das auf das Vorhandensein mehrerer Molekülspezies hindeutete.

Mittels der (pseudo-)zweidimensionalen NMR-spektroskopischen Methode 1H-DOSY konnte ein für alle Signale übereinstimmender Diffusionskoeffizient erhalten werden. Dies gab einen weiteren Hinweis auf die Bindung des L‑Cysteins an die Goldnanopartikel. Insbesondere konnte auf diesem Wege der hydrodynamische Durchmesser der funktionalisierten Goldnanopartikel von durchschnittlich 2.46 ± 0.03 nm berechnet werden, welcher mit dem mittels Differentieller Scheibenzentrifugation gemessenen hydrodynamischen Durchmesser vergleichbar ist.

Der Durchmesser des Goldnanopartikel-Kerns konnte mittels hochauflösender Transmissionselektronenmikroskopie bestimmt werden und lag bei 1.55 ± 0.32 nm. Weiterhin konnte mit dieser Methode gezeigt werden, dass sich die Goldatome in der Metall-typischen fcc-Kristallstruktur anordnen. Dabei sind Facettierungen, die auf Polyeder-Strukturen mit [110]- und [001]-Zonenachsen-Orientierungen hindeutet, erkennbar. Ferner konnte ein dem theoretischen Gitterebenenabstand vergleichbarer Abstand bestimmt werden.

Mit Hilfe der Röntgenphotoelektronenspektroskopie konnte der Oxidationszustand der Goldnanopartikel untersucht werden. Es konnte gezeigt werden, dass die Goldnanopartikel zu 95 % aus elementarem und zu 5 % aus oxidiertem Gold bestehen. Das zu AuI+oxidierte Gold lässt sich den Oberflächen-Goldatomen mit gebundenem L‑Cystein zuordnen.

Das Oberflächenpotential der L‑Cystein-funktionalisierten Goldnanopartikel wurde über die Messung des Strömungspotentials bestimmt. Zusätzlich konnte ein isoelektrischer Punkt ermittelt werden, der dem IEP des L‑Cysteins entspricht. Folglich konnte auch mit dieser Methode ein weiterer Hinweis auf die erfolgreiche Bindung erhalten werden, der ferner auf die Intaktheit des L‑Cysteins auf der Goldnanopartikel-Oberfläche hindeutet.

Weitere Details über die Bindungssituation auf der Goldnanopartikel-Oberfläche konnte die NMR-Spektroskopie mit isotopenmarkierten Liganden liefern. Dafür wurden die Goldnanopartikel mit 13C- und 15N-markiertemL‑Cystein, basierend auf der zuvor genutzten Synthese, hergestellt.

Es konnte anhand der zur Untersuchung der Goldnanopartikel mit unmarkiertem L‑Cystein verwendeten Methoden gezeigt werden, dass auch mit den markierten Varianten des L‑Cysteins vergleichbare Nanopartikel erhalten wurden.

Anhand der mit 13C-markiertem L‑Cystein funktionalisierten Goldnanopartikel konnte zunächst gezeigt werden, dass die Bindung des L‑Cysteins über die Thiol-Gruppe geschieht. Im eindimensionalen 13C-NMR-Spektrum wurde sowohl eine charakteristische Aufspaltung als auch eine Verschiebung des Thiol-Kohlenstoffatom-Signals erhalten, während die Signale für die anderen Kohlenstoffatome im Molekül diese Veränderung durch Anbindung an die Nanopartikel nicht zeigten.

Da eine Aufspaltung des Kohlenstoffatom-Signals für die Thiol-Gruppe in drei Singulett-Signale erfolgt, deutet dies zusammen mit den Strukturen des Partikel-Kerns (erhalten aus der HRTEM) auf drei Bindungspositionen des Liganden auf der Oberfläche desselben Nanopartikels hin. Für alle drei Signale wurde aus 13C-DOSY zudem ein übereinstimmender Diffusionskoeffizient erhalten.

Mit der zweidimensionalen heteronuklearen 1H-13C-HSQC konnte die Zuordnung der Protonensignale entscheidend verbessert werden. Ferner konnte mit dem zweidimensionalen homonuklearen INADEQUATE-Experiment die Intaktheit des Moleküls nach der Bindung an die Partikeloberfläche bestätigt werden.

Mittels quantitativer 13C-NMR-Spektroskopie konnte die Beladung der Partikel mit L‑Cystein bestimmt werden. Es konnte gezeigt werden, dass ein Partikel mit einem Kerndurchmesser von 1.78 nm mit etwa 70 Liganden funktionalisiert ist.

Unterstützend zu den 13C-NMR-Untersuchungen konnte anhand von Partikeln mit 15N-markiertem L‑Cystein dargestellt werden, dass eine Bindung des Liganden an die Goldnanopartikel-Oberfläche über das Stickstoffatom weitestgehend ausgeschlossen werden kann und somit über das Schwefelatom der Thiol-Gruppe erfolgt.

Nachdem die Bindung von L‑Cystein an die Goldnanopartikel-Oberfläche über das Schwefel-Atom der Thiol-Gruppe nachgewiesen wurden und die Bindungssituation sowie die Struktur der Goldnanopartikel-Oberfläche charakterisiert werden konnten, wurden komplexere, auf L‑Cystein aufbauende Liganden auf der Goldnanopartikel-Oberfläche untersucht. Hierfür wurden das Hexapeptid CGGpTPA und darauf aufbauende Modifikation verwendet, welche eine spezifische Bindung der WW-Domäne des Modell-Proteins hPin1 erlauben. Auch für solche funktionalisierten Goldnanopartikel konnte mittels 1H-NMR-Spektroskopie die erfolgreiche Anbindung über die Cystein-Thiol-Gruppe gezeigt, sowie mittels 1H-DOSY ein hydrodynamischer Durchmesser der Partikel von ca. 5 nm ermittelt werden. HRTEM-Aufnahmen dieser Partikel zeigten ebenfalls einen Kerndurchmesser unter 2 nm, sowie eine polyedrische Partikel-Struktur. Mit spektroskopischen Methoden, wie der UV-Vis- und der quantitativen 1H-NMR-Spektroskopie, konnte eine Oberflächenbeladung von ca. 150 Peptiden pro Nanopartikel erhalten werden.

Der Fokus der Untersuchungen an Goldnanopartikeln funktionalisiert mit dem spezifischen Peptid und seinen Modifikationen lag auf der Interaktion mit der WW-Domäne. Diese Interaktion wurde anhand verschiedener Arten der NMR-Titration, ITC sowie Fluoreszenzpolarisation untersucht. Dabei konnte je nach Methode zur Untersuchung eine Dissoziationskonstante in einem Bereich zwischen 10 – 60 µM für das an Nanopartikel gebundene Peptid erhalten werden. Vergleichbare Dissoziationskonstanten wurden auch für das ungebundene Peptid erhalten.

Folglich wird die Bindung der hPin1-WW-Domäne durch die Bindung des Peptids an Goldnanopartikel nicht signifikant beeinflusst. Eine direkte Wechselwirkung zwischen Goldnanopartikeln und der hPin1-WW-Domäne konnte in Kontrollexperimenten mit einem vergleichbar aufgebauten, aber unspezifischen Peptid ausgeschlossen werden. Ausgehend von den erhaltenen Daten und unter der Annahme eines Bindungsverhältnisses von 1:1 konnte eine Bindung von ca. 15 Proteinen pro funktionalisiertem Goldnanopartikel abgeschätzt werden.

Vergleichende Wechselwirkungsuntersuchungen mit einer komplexeren Peptidsequenz und dem spezifisch bindenden Protein 14-3-3σ führten zu analogen Ergebnissen. In dieser Peptidsequenz befindet sich das an die Partikel bindende Cystein anders als zuvor mittig in der Sequenz. Folglich hat die Position des Cysteins in der Peptidsequenz keinen signifikanten Einfluss auf die Bindung an die Goldnanopartikel-Oberfläche und die anschließende Peptid-Protein-Interaktion.

In Zellexperimenten konnte die Aufnahme von Peptid-funktionalisierten ultrakleinen Goldnanopartikeln durch HeLa-Zellen nachgewiesen werden. Dabei konnten mittels der Konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie die Partikel um den Zellkern herum lokalisiert werden. Ferner ließ sich die Verträglichkeit der hergestellten ultrakleinen Goldnanopartikel gegenüber den Zellen mittels des MTT-Tests feststellen.

Die in dieser Arbeit erhaltenen Ergebnisse stellen einen wichtigen Ausgangspunkt für die Grundlagenforschung sowie für die medizinische Anwendung von Goldnanopartikeln dar.

Eine Modifizierung der Methode nach Schütze et al. sowie die Erweiterung durch einen Aufreinigungsschritt konnte die Herstellung von reinen, ultrakleinen Goldnanopartikeln mit einer spezifischen Oberfläche ermöglichen. Zusätzlich konnten die synthetisierten Goldnanopartikel vielseitig untersucht werden.

Mit Hilfe der NMR-Spektroskopie und der Elektronenmikroskopie konnten Einblicke in die Oberflächenstruktur von ultrakleinen L‑Cystein-funktionalisierten Goldnanopartikel erhalten werden, die zusätzlich Erkenntnisse über die Funktionalisierung und Zusammensetzung von Goldnanopartikeln liefern.

Für weiterführende kristallographische Untersuchungen hinsichtlich der Kristallstruktur und der Zusammensetzung kann die Optimierung der dargestellten Synthese und Aufreinigung zu Nanopartikel-Dispersionen mit besonders schmaler Partikelgrößenverteilung und hoher Konzentration Schwerpunkt zukünftiger Forschungsarbeiten sein.

Die Aminosäure L‑Cystein, welche für die erfolgreiche und gutbeschreibbare Funktionalisierung sowie Stabilisierung der Goldnanopartikel-Oberfläche verwendet wurde, eignet sich besonders für anknüpfende Untersuchungen der Nanopartikel-Oberfläche. So kann der chirale Ligand L‑Cystein seine optische Aktivität auf die Goldnanopartikel-Oberfläche übertragen und somit dem Gold-Kern chirale Eigenschaften verleihen. Darauf aufbauend sind spektroskopische Untersuchungen des Zirkulardichroismus (CD-Spektroskopie), welche bereits in einigen Arbeiten an Goldnanopartikeln eingesetzt wurden, möglich.

Basierend auf L‑Cystein-stabilisierten Goldnanopartikeln konnte zudem die spezifische Interaktion Peptid-funktionalisierter ultrakleiner Goldnanopartikel mit Proteinen und Zellen demonstriert werden, sodass eine Anwendung solcher Goldnanopartikel auf subzellulärer Ebene insbesondere für den Wirkstoff-Transport durch die Blut-Hirn-Schranke (BHS) denkbar ist. Unter physiologischen Bedingungen ist die BHS nicht permeabel bzw. zeigt eine limitierte Durchlässigkeit. Jedoch können besonders kleine Strukturen mit einer spezifischen Oberfläche über verschiedene Transportprozesse zu- bzw. abgeführt werden. Ultrakleine Goldnanopartikel, die in dieser Arbeit hergestellt wurden und für die eine Aufnahme in Zellen gezeigt werden konnte, stellen solche speziellen Strukturen dar. Zusammen mit der ermittelten hohen Beladung sind derartige Partikel besonders als Wirkstoffträgersystem von besonderem Interesse. Darauf aufbauend können weitere Untersuchungen im physiologischen Medium durchgeführt werden, insbesondere hinsichtlich der Ausbildung einer Protein-Corona um die Goldnanopartikel und deren Auswirkung.

In the present work first insights into the interaction behaviour of specifically functionalized ultrasmall gold nanoparticles with proteins could be obtained. The focus was on the specific functionalization of the nanoparticle surface as well as the elucidation of its structure and loading capacity. Based on this, the interaction of gold nanoparticles with proteins could be investigated and a protein-to-nanoparticle ratio could be estimated.

Due to the size of the gold nanoparticles, NMR spectroscopy is particularly suitable for such investigations, but methods such as isothermal titration calorimetry (ITC) and fluorescence polarization were also used as supporting tools.

The starting point was the aqueous synthesis of ultrasmall gold nanoparticles with direct surface functionalization with the amino acid L‑Cysteine according to the method of Schütze et al. A stable, covalent bond is formed with the gold nanoparticle surface via the thiol group of L‑Cysteine. Furthermore (as a component of peptides and proteins), L‑Cysteine can act as a binding building block for the binding of specific ligands, which in turn can enter into a specific interaction with protein epitopes.

First, the size and chemical structure of gold nanoparticles functionalized with unlabeled L‑Cysteine was characterized. The focus here was on the binding behavior of the molecule on the nanoparticle surface.

The chemical structure of the produced gold nanoparticles and the binding of the ligand to the surface were initially investigated by one- and two-dimensional NMR spectroscopy. This provided a first indication of successful binding of the ligand. The 1H-NMR spectrum of the functionalized gold nanoparticles shows deeply shifted, multiple split and broadened signals in comparison to the 1H-NMR spectrum of the unbound L‑Cysteine. At this point an exact signal assignment in the 1H-NMR spectrum was not possible. Assignment using two-dimensional NMR spectroscopy (1H-1H-COSY) also proved difficult. The multiple split signals show a complex coupling pattern that indicates the presence of several molecular species.

By means of the (pseudo-)2D-NMR spectroscopic method 1H-DOSY a diffusion coefficient could be obtained that was identical for all signals. This gave a further indication of the binding of L‑Cysteine to the gold nanoparticles. In particular, the hydrodynamic diameter of the functionalized gold nanoparticles of 2.46 ± 0.03 nm in average could be calculated in this way, which is comparable with the hydrodynamic diameter measured by differential centrifugation sedimentation.

The diameter of the gold nanoparticle core could be determined by high-resolution transmission electron microscopy and was 1.55 ± 0.32 nm. Furthermore, this method was able to show that the gold atoms arrange themselves in the metal-typical fcc crystal structure. A faceting indicates polyhedron structures with an [100]- and [001]-orientation.

With the help of X-ray photoelectron spectroscopy, the oxidation state of the gold nanoparticles could be investigated. It could be shown that the gold nanoparticles consist of 95 % elemental gold and 5 % oxidized gold. The gold oxidized to AuI+ can be assigned to surface gold atoms with bound L‑Cysteine.

The surface potential of the L‑Cysteine-functionalized gold nanoparticles was determined by measuring the flow potential. In addition, an isoelectric point corresponding to the IEP of L‑Cysteine was determined. Consequently, this method was also able to provide a further indication of successful binding, which also indicates the intactness of the L‑Cysteine on the gold nanoparticle surface.

NMR spectroscopy with isotope-labeled ligands provided further details about the binding situation on the gold nanoparticle surface. For this purpose, the gold nanoparticles were prepared with 13C- and 15N-labeled L‑Cysteine, based on the previously used synthesis.

Using the methods used to examine the gold nanoparticles with unlabeled L‑Cysteine, it could be shown that nanoparticles comparable to the labeled variants of L‑Cysteine were obtained.

Using the gold nanoparticles functionalized with 13C-labeled L‑Cysteine, it could first be shown thatL‑Cysteine is bound via the thiol group. In the one-dimensional 13C-NMR spectrum, both a characteristic splitting and a shift of the thiol-carbon signal was obtained, whereas the signals for the other carbon atoms in the molecule did not show this change due to binding to the nanoparticles.

Since splitting of the carbon signal for the thiol group into three singlet signals occurs, this, together with the structures of the particle nucleus (obtained from HRTEM), indicates three binding positions of the ligand on the surface of the same nanoparticle. For all three signals a matching diffusion coefficient was obtained from variants of the 13C-DOSY.

With the two-dimensional heteronuclear 1H-13C-HSQC the assignment of the proton signals could be improved significantly. Furthermore, the two-dimensional homonuclear INADEQUATE experiment confirmed the intactness of the molecule after binding to the particle surface.

By means of quantitative 13C-NMR spectroscopy the loading of the particles with L‑Cysteine could be determined. It could be shown that a particle with a core diameter of 1.78 nm is functionalized with about 70 ligands.

In support of the 13C-NMR investigations, it was shown that particles with 15N-labeled L‑Cysteine are largely unable to bind the ligand to the gold nanoparticle surface via the nitrogen atom and thus via the sulfur atom of the thiol group.

After the binding of L‑Cysteine to the gold nanoparticle surface via the sulfur atom of the thiol group had been detected and the binding situation and structure of the gold nanoparticle surface had been characterized, more complex ligands based on L‑Cysteine were investigated on the gold nanoparticle surface. For this purpose, the hexapeptide CGGpTPA and modification were used, which allow specific binding of the WW domain of the model protein hPin1. Also, for such functionalized gold nanoparticles the successful binding via the cysteine-thiol group could be shown by 1H-NMR spectroscopy and a hydrodynamic diameter of the particles of about 5 nm could be determined by 1H-DOSY. HRTEM images of these particles also showed a core diameter below 2 nm and a polyhedral particle structure. With spectroscopic methods, such as UV-Vis and quantitative 1H-NMR, a surface loading of approx. 150 peptides per nanoparticle could be obtained.

The focus of the investigations on gold nanoparticles functionalized with the specific peptide and its modifications was the interaction with the WW domain. This interaction was investigated using different types of NMR titration, ITC and fluorescence polarization.

Depending on the method of investigation, a dissociation constant in a range between 10 – 60 µM could be obtained for the peptide bound to nanoparticles. Comparable dissociation constants were also obtained for the unbound peptide.

Consequently, the binding of the hPin1-WW domain is not significantly influenced by the peptide's binding to gold nanoparticles. A direct interaction between gold nanoparticles and the hPin1-WW domain could be excluded in control experiments with a comparably constructed but unspecific peptide. Based on the obtained data and assuming a binding ratio of 1:1, a binding of about 15 proteins per functionalized gold nanoparticle could be estimated.

Comparative interaction studies with a more complex peptide sequence and the specific binding protein 14-3-3σ led to analogous results. In this peptide sequence, the cysteine that binds to the particles is located in the middle of the sequence, unlike before. Consequently, the position of the cysteine in the peptide sequence has no significant influence on the binding to the gold nanoparticle surface and the subsequent peptide-protein interaction.

In cell experiments the uptake of peptide-functionalized ultrasmall gold nanoparticles by HeLa cells could be demonstrated. Confocal laser scanning microscopy was used to localize the particles around the cell nucleus. Furthermore, the compatibility of the produced ultrasmall gold nanoparticles with the cells could be determined by means of the MTT test.

The results obtained in this work represent an important starting point for basic research as well as the medical application of gold nanoparticles.

A modification of the method of Schütze et al. as well as the extension by a purification step could enable the production of pure, ultrasmall gold nanoparticles with a specific surface. In addition, the synthesized gold nanoparticles could be investigated in a variety of ways.

With the help of NMR spectroscopy and electron microscopy, insights into the surface situation of ultrasmall L‑Cysteine-functionalized gold nanoparticles can be obtained, which additionally provide knowledge about the functionalization and composition of gold nanoparticles.

For further crystallographic investigations regarding crystal structure and composition, the optimization of the presented synthesis and purification to nanoparticle dispersions with a particularly narrow particle size distribution and high concentration may be the focus of future research work.

The amino acid L‑Cysteine, which was used for the successful and well-describable functionalization and stabilization of the gold nanoparticle surface, is particularly suitable for subsequent investigations of the nanoparticle surface.

The chiral Ligand L‑Cysteine can transfer his chirality onto the gold nanoparticle surface. Following, spectroscopic investigation of circular dichroism (CD spectroscopy), which has already been used in some work on gold nanoparticles, is also suitable for further characterization.

Based on L‑Cysteine-stabilized gold nanoparticles, the specific interaction of peptide-functionalized ultrasmall gold nanoparticles with proteins and cells could be demonstrated, so that an application of such gold nanoparticles at the sub-cellular level is conceivable, especially for the transport of active substances through the blood-brain barrier (BBB). Under physiological conditions the BBB is not permeable or shows limited permeability. However, particularly small structures with a specific surface can be supplied or removed via various transport processes. Ultrasmall gold nanoparticles, which were produced in this work and for which uptake into cells could be shown, represent such special structures. Together with the determined high loading, such particles are of particular interest as drug delivery systems. Based on this, further investigations can be carried out in the physiological medium, especially regarding the formation of a protein corona around the gold nanoparticles and their effects.

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Ruks, T., 2021. Die Anbindung von Epitop-spezifischen Peptiden an ultrakleine Goldnanopartikel. https://doi.org/10.17185/duepublico/73700
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