Wirkung von β-Alanin und Aprotinin in der akuten mesenterialen Ischämie der Ratte : Einfluss pankreatischer Verdauungsenzyme auf die Aktivierung peritonealer Makrophagen in vitro

Bei der akuten mesenterialen Ischämie handelt es sich um ein lebensbedrohliches Krankheitsbild, welches in den meisten Fällen durch einen Verschluss der zuführenden arteriellen Gefäßen bedingt ist. Trotz intensiver Forschungen ist eine frühe Diagnose derzeit der beste prognostische Faktor und die Mortalität liegt weiterhin bei etwa 50 bis 90%.  
In früheren Studien konnte gezeigt werden, dass die Applikation von Glycin zu einer Abmilderung der Darmschädigung nach akuter mesenterialer Ischämie in der Ratte führte. Um den Wirkmechanismus des Glycins besser zu verstehen, sollte nun untersucht werden, ob auch der Glycin-Rezeptor-Agonist β-Alanin einen vergleichbaren Effekt in diesem Rattenmodell zeigte. Da sich dabei ein protektiver Effekt auf die Darmschädigung zeigte, ein systemischer Effekt jedoch ausblieb, sollte in einem nächsten Schritt die Wirkung der kombinierten Gabe von β-Alanin und Aprotinin untersucht werden. Denn auch für Aprotinin konnte in früheren Studien nur eine auf den Darm beschränkte Schutzwirkung gezeigt werden. Weiter sollte in vitro untersucht werden, ob neben Bakterien auch pankreatische Verdauung-enzyme, die nach akuter Ischämie die Darmwand passieren und in die Peritonealhöhle gelangen können, zu dem Entstehen einer lebensbedrohlichen Durchwanderungsperitonitis, einer lebensbedrohlichen Folge der mesenterialen Ischämie, beitragen können.  
Um den Effekt von β-Alanin und Aprotinin in der akuten mesenterialen Ischämie mit anschließender Reperfusion zu untersuchen, wurde ein Rattenmodell mit anästhesierten Ratten verwendet. Hierbei wurde die Ischämie durch das Abklemmen der Arteria mesenterica superior simuliert. Die anschließende Reperfusion wurde durch das Öffnen der Klemme eingeleitet. Zu definierten Zeitpunkten wurde β-Alanin allein oder in Kombination mit Aprotinin verabreicht.
Um den Effekt von Verdauungsenzymen in dem Pathomechanismus der Durchwanderungsperitonitis zu untersuchen, wurden peritoneale Makrophagen aus dem Abdomen von Mäusen isoliert. Die entnommenen Zellen wurden kultiviert und anschließend mit Trypsin, Chymotrypsin, Lipase, pankreatischer Elastase und α-Amylase inkubiert. Als Kontrolle diente die Inkubation mit Lipopolysaccharid, einem Bestandteil der äußeren Membran gramnegativer Bakterien.   
Anhand der Ergebnisse zeigte sich, dass die alleinige Gabe von 100 mg/kg Körpergewicht β-Alanin zwar zu einer deutlichen Abschwächung der Darmschädigung führte, jedoch keinen systemischen Einfluss auf die Ischämie-Reperfusions-bedingte Schädigung hatte. Insgesamt ergaben sich Hinweise, dass die Wirkung von β-Alanin sehr wahrscheinlich über den Glycin-Rezeptor vermittelt worden ist. Im Gegensatz dazu führte die kombinierte Gabe von β-Alanin und Aprotinin neben einem protektiven Effekt auf die Darmschädigung auch zu einer abgemilderten systemischen Schädigung. Es zeigte sich also, dass die Kombination beider Substanzen zu einem potenzierten Effekt in der Darmischämie führen und einen interessanter Ansatz in der prophylaktischen Therapie von Hochrisiko-Patienten in der in der Klinik darstellen könnte.    
In vitro zeigte sich für Trypsin, Chymotrpysin und die Lipase kein pro-inflammatorischer Ef-fekt auf die Makrophagen. Die pankreatische Elastase und α-Amylase hingegen bewirkten eine deutliche Aktivierung der Peritoneal-Makrophagen, was eine wichtige Rolle dieser Enzyme in der Entstehung einer Durchwanderungsperitonitis vermuten lässt. 

Acute mesenteric ischemia is often caused by the embolization of the mesenteric arterial circulation and is associated with a high mortality of about 50 to 90%.In previous studies, the single application of glycine caused an ameliorated intestinal damage after ischemia-reperfusion in rats. In a first step, we investigated whether the glycine-receptor agonist β-alanine evokes the same beneficial effect in intestinal ischemia-reperfusion, because we speculated that glycine acted here as a signal molecule. Since the single application of β-alanine caused an ameliorated intestinal damage but failed to improve systemic tissue injuries, in a further step the intravenous application of β-alanine was combined with the intraluminal application of aprotinin, whose single application had an isolated protective effect on the small intestine in previous studies, too. During ischemia, breakdown of intestinal wall can be observed. Both, intestinal bacteria and pancreatic digestive enzymes can therefore enter the abdominal cavity. Bacteria, among other things, activate the immune system through lipopolysaccharides. Already, previous studies have shown that the inhibition of trypsin is contributed to reduced intestinal damage after ischemia. Therefore, it should now be investigated whether digestive enzymes also play a role in the development of peritonitis and inflammation. For this purpose, the activation of peritoneal macrophages by digestive enzymes was investigated in vitro. To analyze the effect of β-alanine and aprotinin in acute ischemia and reperfusion of the small intestine, a model with anesthetized rats was used. Therefore, ischemia and reperfusion were initiated by occluding and re-opening the superior mesenteric artery. To analyze the effect of different pancreatic enzymes, peritoneal macrophages were isolated from the abdominal cavity of mice, that were previously killed by cervical dislocation. After isolation, macrophages were cultivated and incubated with different digestive enzymes or lipopolysaccharide. After incubation, concentration of tumor necrosis factor α was measured in the cell culture medium. The, application of  β-alanine clearly diminished intestinal tissue damage, getting visible on macroscopic and histologic level. In addition, I/R-mediated decrease of saccharase activity and However, β-alanine did not change systemic parameters as blood pressure or lactate level. The combination of β-alanine and aprotinin resulted in a clearly stabilized mean arterial blood pressure and blood glucose level during the reperfusion period. Further, the combined administration caused significantly reduced tissue damage parameters, cytokine and cell-free hemoglobin concentrations in blood plasma. In addition, the damage to the small intestine was significantly attenuated, so that the animals ultimately survived the entire test period due to the administration of both substances. The incubation with lipopolysaccharide of gram-negative bacteria activated peritoneal macrophages, getting visible in an increased tumor necrosis factor α concentration in cell culture medium. Pancreatic trypsin, chymotrypsin and lipase failed to activate the isolated macrophages in vitro. In contrast, pancreatic lipase and elastase induced tumor necrosis factor α production and thus activated peritoneal macrophages. All in all, it could be demonstrated that the single application of β-alanine was a potent agent to ameliorate I/R-induced injury of the small intestine. Due to its diminishing effect on the accumulation of macrophages, the amino acid is strongly expected to mediate its beneficial effect via glycine receptors. While systemic effects were missing, the simultaneous application of both aprotinin and β-alanine leads to a synergistic and systemic protection without the occurrence of undesirable side effects. Therefore, the combined usage of β-alanine and aprotinin can be seen as a promising approach to inhibit the onset of acute mesenteric ischemia in a prophylactical manner. Since even elastase and amylase can activate peritoneal macrophages in vitro, both enzymes might play a role in the development of peritoneal inflammation and possibly are involved in the pathomechanism of intestinal injury by activating resistant macrophages of the Lamina propria.

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Dominowski, L., 2020. Wirkung von β-Alanin und Aprotinin in der akuten mesenterialen Ischämie der Ratte: Einfluss pankreatischer Verdauungsenzyme auf die Aktivierung peritonealer Makrophagen in vitro. https://doi.org/10.17185/duepublico/73540
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