Role of the Rac1-P29S driver mutation in tumorigenesis and acquisition of BRAF inhibitor resistance
Die Rho-GTPase Rac1 kontrolliert das Aktin-Zytoskelett und reguliert so die Zelldynamik. Kürzlich wurde in Melanomzellen die hoch-aktive „fast-cycling“ Mutante Rac1-P29S entdeckt, welche neben den lang bekannten Mutationen in BRAF und NRAS eine neue Hot-Spot-Mutation im Melanom darstellt. Erste Studien legen nahe, dass die endogene Expression von Rac1-P29S eine verstärkte Zellproliferation verursacht und hierfür die Aktivierung des MAPK-Signalwegs verstärkt. Darüber hinaus wird vorgeschlagen, dass Rac1-P29S die frühe Metastasierung beim Melanom fördert und zur Bildung einer Resistenz gegen BRAF Inhibitoren beiträgt. Es ist jedoch wenig bekannt, wie diese Treibermutation diese Prozesse reguliert. Das Ziel dieser Studie war es daher, die Rolle von Rac1-P29S bei der Zellproliferation, dem Zellüberleben sowie bei der Resistenz gegen BRAF-Inhibitoren zu charakterisieren und molekulare Mechanismen zu identifizieren, die diese Funktionen vermitteln. Zu diesem Zweck konzentrierten wir uns auf zwei verschiedene vom Patienten stammende Melanomzelllinien. Beide Zelllinien weisen eine aktivierende BRAF-Mutation auf, exprimieren jedoch unterschiedliche Rac1-Varianten. Während in den Ma-Mel-86c Zellen der Rac1-wildtyp (wt) endogen exprimiert wird, wurde die Rac1-P29S-Mutante in der UKE-Mel-55b Zelllinie gefunden. Die Morphologie der UKE-Mel-55b Zellen unterscheidet sich deutlich von den Ma-Mel86c Zellen und zeichnet durch eine erhöhte Lamellipodien- und Membran „ruffling“ Bildung aus. Im ersten Teil dieser Studie verwendeten wir RNA-Interferenz zusammen mit der Expression von siRNA-resistenten Konstrukten, um zu bestätigen, dass Rac1-P29S diesen Phänotyp tatsächlich induziert. Darüber hinaus haben wir festgestellt, dass die endogene Expression von Rac1-P29S in UKE-Mel-55b Zellen für eine effiziente frühe Zelladhäsion und Zellausbreitung sowie für deren Migrationsfähigkeit erforderlich ist. Als nächstes konnten wir zeigen, dass Rac1-P29S für die stark erhöhte Proliferation von UKE-Mel55b-Zellen erforderlich ist, während Rac1-wt in Ma-Mel-86c-Zellen die Zellproliferation nicht beeinflusst. Die prominente Rolle von Rac1-P29S in der Zellproliferation von UKE-Mel-55b Zellen wurde ebenfalls daraus ersichtlich, dass wir in videomikroskopischen Lebendzellaufnahmen eine signifikante Abnahme der Zellteilung, sowie eine ausgeprägte mitotische Verzögerung nach Rac1- Depletion feststellten. Als nächstes untersuchten wir das MAPK-Protein ERK1/2, das Zellüberlebensprotein AKT und die Aktin-regulierten Transkriptions-koaktivatoren Yap/Taz als potenzielle Signalwege stromabwärts von Rac1-P29S. Wir konnten zeigen, dass Rac1-P29S und Rac1-wt die AKT-Aktivität ähnlich beeinflussen. Im Gegensatz dazu stimuliert Rac1-P29S die Aktivitäten der proliferationsbezogenen Proteine ERK1/2 und Yap/Taz im Vergleich zu Rac1-wt deutlich stärker. So war zum einen die nukleare Lokalisation von Yap/Taz in UKE Mel 55b Zellen signifikant höher als in den Rac1-wt Ma Mel-86c Zellen. Des Weiteren verringerte die Depletion von Rac1-P29S in UKE-Mel-55b Zellen die Aktivitäten von ERK1/2 und Yaz/Taz deutlich, wohingegen das Fehlen von Rac1-wt in Ma-Mel-86c-Zellen keinen merklichen Effekt auf diese Signalproteine hatte. Unsere Studien zeigten ebenfalls eine signifikant erhöhte Aktivitäten der PAK-Familie in UKE-Mel-55b-Zellen im Vergleich zu Ma-Mel-86c-Zellen. Dies impliziert das die PAK-Proteine als wichtige Effektoren bei der verstärkten Zellproliferation stromabwärts von Rac1-P29S fungieren könnten. Im zweiten Teil konzentrierten wir uns auf die Rolle von Rac1-P29S beim Erwerb der BRAFInhibitorresistenz in Melanomzellen und untersuchten mögliche Auswirkungen auf die damit verbundenen Signalwege. Insgesamt legen unsere Proliferationsstudien nahe, dass die Expression von Rac1-P29S in Melanomzellen einen Vorteil bei der Proliferation im Vergleich zu Rac1-wt bietet. Während die Proliferationsrate in Rac1-wt Zellen während der Behandlung mit dem BRAFInhibitor (PLX-4032) stark verringert blieb, konnten wir in Rac1-P29S exprimierenden Zellen eine deutliche Erholung der Proliferation in Rac1 messen. Interessanterweise ging die Aktivität des MAPK-Proteins ERK1/2 in Rac1-wt Zellen nach PLX-4032-Behandlung vollständig verloren, während ein erhebliches Restaktivitätsniveau in der Rac1-P29S-Zelllinie gemessen wurde. Darüber hinaus führte die Depletion von Rac1-P29S zu einer weiteren Verringerung der verbleibende ERK1/2-Aktivität, was ebenfalls darauf hinweist, dass die endogene Expression dieser Rac1-Variante im Melanomzellen die ERK1/2-Aktivierung während der Behandlung mit BRAF-Inhibitoren stimuliert. Zusätzlich führte die BRAF-Hemmung zu einer erhöhten nuklearen Yap/Taz-Lokalisierung in beiden Zelllinien. Die Depletion von Rac1-P29S reduzierte diesen Effekt jedoch signifikant, was darauf hindeutet, dass die Mutante die Aktivität dieser Transkriptionskoaktivatoren bei BRAF-Hemmung fördert. Eine verstärkte Bildung von Stressfasern nach PLX4032-Behandlung in beiden Melanomzelllinien deutete darauf hin, dass neben Rac1-P29S auch weitere Rho-GTPases, welche die Kontraktilität regulieren, an dem Erwerb der Arzneimittelresistenz beteiligt sein könnten. Während die Bildung von Stressfasern typischerweise mit RhoA assoziiert ist, legen unsere vorläufigen Ergebnisse unter Verwendung von RNAi und dem C3-Inhibitor nahe, dass die Aktivitäten von RhoB und RhoC in diesem zellulären Kontext funktionell relevanter sein könnten. Zusammengenommen haben unsere Ergebnisse eine stimulierende Rolle der Rac1-P29S Mutation bei der tumorbedingten Zellproliferation festgestellt und unser Verständnis erweitert, wie diese Mutation die Resistenz gegen BRAF-Inhibitoren bei Melanompatienten fördern könnte. Die gezielte Hemmung der nachgeschalteten Signalwege der Rac1-P29S-Mutation könnte daher die Entwicklung neuer pharmakologischer Behandlungsstrategien für Melanompatienten ermöglichen.