Role of the Rac1-P29S driver mutation in tumorigenesis and acquisition of BRAF inhibitor resistance

The Rho-GTPase Rac1 is well-known to control the actin cytoskeleton. Recently, the highly active fast-cycling Rac1-P29S mutant was identified as a new driver mutation in melanoma beside the long-characterized mutations in BRAF and NRAS. Initial studies suggest that Rac1-P29S in linked to enhanced melanoma cell proliferation by activation of the MAPK protein ERK 1/2. Moreover, it is proposed that Rac1-P29S promotes early metastatic progression of melanoma and adaption of BRAF inhibitor resistance. However, little is known how this driver mutation regulates these processes. The aim of this study was therefore to characterize the role of Rac1-P29S in cell proliferation, cell survival as well as in BRAF inhibitor resistance and to identify molecular mechanisms that mediate these functions. For this, we focused on two different patient-derived melanoma cell lines. Both cell lines harbor an activating BRAF mutation but express different Rac1 variants. While Rac1-wildtype (wt) is endogenously expressed in Ma-Mel-86c cells, the Rac1-P29S mutant was found in the UKE-Mel-55b cell line. The characteristic morphology of these cells, including enhanced lamellipodia formation and dynamic membrane ruffling differs substantially from the Rac1-wt expressing Ma-Mel-86c cell line. In the first part of this study, we used RNA interference together with expression of siRNA-resistant constructs to confirm that Rac1-P29S indeed promote this phenotype. In addition, we also established that endogenous expression of Rac1-P29S in UKE-Mel-55b cells is required for accelerated early cell adhesion and spreading as well as for their migratory capacity. Next, we could show that Rac1-P29S is required for the strongly enhanced proliferation of UKE-Mel-55b cells, while Rac1-wt in Ma-Mel-86c cells does not modulate cell proliferation substantially. In agreement with such prominent role of Rac1-P29S in proliferation in UKE-Mel-55b cells, live-cell imaging revealed a significant decrease of cell division as well as a pronounced mitotic delay upon Rac1 depletion. We next studied the MAPK protein ERK1/2, the cell survival protein AKT and the actin regulated transcriptional coactivators Yap/Taz as potential downstream effectors. Data suggest that Rac1-P29S expression similarly modulates AKT activity as compared to Rac1-wt expressing cells. In contrast, Rac1-P29S strongly stimulates activities of the proliferation related proteins ERK1/2 and Yap/Taz as compared to Rac1-wt. First, Yap/Taz levels were significantly higher in UKE-Mel-55b cells as compared to Ma-Mel86c. In addition, Rac1-P29S depletion in UKE-Mel-55b cells distinctly decreased activitie of ERK1/2 and Yaz/Taz, whereas lack of Rac1-wt in Ma-Mel-86c cells did not have any marked effect on these signaling proteins. Our studies also revealed significantly elevated activities of the PAK effector family in UKE-Mel-55b cells as compared to Ma-Mel-86c cells. This implicates the PAK proteins as important effectors in enhanced cell proliferation downstream of Rac1-P29S. In the second part, we focused on the role of Rac1-P29S in the acquisition of BRAF inhibitor resistance in melanoma cells and studied potential effects on associated signaling pathways. Overall, our proliferation studies suggest that expression of Rac1-P29S in melanoma cells provides an advantage in proliferation as compared to Rac1-wt. In particular, proliferation rates during treatment with the BRAF inhibitor remained low in Rac1-wt cells, while we measured a marked recovery of proliferation in Rac1-P29S expressing cells, despite continuous inhibitor (PLX-4032) treatment. Interestingly, activity of the MAPK protein ERK1/2 in Rac1-wt cells was lost entirely after PLX-4032 treatment, while a substantial residual activity level in the Rac1-P29S cell line was measured. Depletion of Rac1-P29S significantly decrease the residual ERK1/2 activity, further indicating that endogenous expression of this Rac1 variant in melanoma stimulates ERK1/2 activation during BRAF inhibitor treatment. In addition, BRAF inhibition lead to increased nuclear Yap/Taz localization in both cell lines. Depletion of Rac1-P29S reduced this effect significantly, suggesting that the driver mutant promotes activity of these transcriptional coactivators upon BRAF inhibition. Enhanced stress fiber formation upon PLX-4032 treatment in both melanoma cell lines suggested that contractility regulatory Rho-GTPase might be also involved in acquisition of drug resistance in addition to Rac1-P29S. While stress fiber formation is typically associated with RhoA, our preliminary results with RNAi and the C3 inhibitor suggest that activities of RhoB and RhoC might be functionally more relevant in this cellular context. Taken together, our findings have established a stimulatory role of the Rac1-P29S driver mutation in tumor-related cell proliferation and advanced our understanding of how this mutation might promote BRAF inhibitor resistance in melanoma patients. Thus, the targeted inhibition of downstream signaling pathways of the Rac1-P29S mutation could therefore enable the development of new pharmacological treatment strategies for melanoma patients.

Die Rho-GTPase Rac1 kontrolliert das Aktin-Zytoskelett und reguliert so die Zelldynamik. Kürzlich wurde in Melanomzellen die hoch-aktive „fast-cycling“ Mutante Rac1-P29S entdeckt, welche neben den lang bekannten Mutationen in BRAF und NRAS eine neue Hot-Spot-Mutation im Melanom darstellt. Erste Studien legen nahe, dass die endogene Expression von Rac1-P29S eine verstärkte Zellproliferation verursacht und hierfür die Aktivierung des MAPK-Signalwegs verstärkt. Darüber hinaus wird vorgeschlagen, dass Rac1-P29S die frühe Metastasierung beim Melanom fördert und zur Bildung einer Resistenz gegen BRAF Inhibitoren beiträgt. Es ist jedoch wenig bekannt, wie diese Treibermutation diese Prozesse reguliert. Das Ziel dieser Studie war es daher, die Rolle von Rac1-P29S bei der Zellproliferation, dem Zellüberleben sowie bei der Resistenz gegen BRAF-Inhibitoren zu charakterisieren und molekulare Mechanismen zu identifizieren, die diese Funktionen vermitteln. Zu diesem Zweck konzentrierten wir uns auf zwei verschiedene vom Patienten stammende Melanomzelllinien. Beide Zelllinien weisen eine aktivierende BRAF-Mutation auf, exprimieren jedoch unterschiedliche Rac1-Varianten. Während in den Ma-Mel-86c Zellen der Rac1-wildtyp (wt) endogen exprimiert wird, wurde die Rac1-P29S-Mutante in der UKE-Mel-55b Zelllinie gefunden. Die Morphologie der UKE-Mel-55b Zellen unterscheidet sich deutlich von den Ma-Mel86c Zellen und zeichnet durch eine erhöhte Lamellipodien- und Membran „ruffling“ Bildung aus. Im ersten Teil dieser Studie verwendeten wir RNA-Interferenz zusammen mit der Expression von siRNA-resistenten Konstrukten, um zu bestätigen, dass Rac1-P29S diesen Phänotyp tatsächlich induziert. Darüber hinaus haben wir festgestellt, dass die endogene Expression von Rac1-P29S in UKE-Mel-55b Zellen für eine effiziente frühe Zelladhäsion und Zellausbreitung sowie für deren Migrationsfähigkeit erforderlich ist. Als nächstes konnten wir zeigen, dass Rac1-P29S für die stark erhöhte Proliferation von UKE-Mel55b-Zellen erforderlich ist, während Rac1-wt in Ma-Mel-86c-Zellen die Zellproliferation nicht beeinflusst. Die prominente Rolle von Rac1-P29S in der Zellproliferation von UKE-Mel-55b Zellen wurde ebenfalls daraus ersichtlich, dass wir in videomikroskopischen Lebendzellaufnahmen eine signifikante Abnahme der Zellteilung, sowie eine ausgeprägte mitotische Verzögerung nach Rac1- Depletion feststellten. Als nächstes untersuchten wir das MAPK-Protein ERK1/2, das Zellüberlebensprotein AKT und die Aktin-regulierten Transkriptions-koaktivatoren Yap/Taz als potenzielle Signalwege stromabwärts von Rac1-P29S. Wir konnten zeigen, dass Rac1-P29S und Rac1-wt die AKT-Aktivität ähnlich beeinflussen. Im Gegensatz dazu stimuliert Rac1-P29S die Aktivitäten der proliferationsbezogenen Proteine ERK1/2 und Yap/Taz im Vergleich zu Rac1-wt deutlich stärker. So war zum einen die nukleare Lokalisation von Yap/Taz in UKE Mel 55b Zellen signifikant höher als in den Rac1-wt Ma Mel-86c Zellen. Des Weiteren verringerte die Depletion von Rac1-P29S in UKE-Mel-55b Zellen die Aktivitäten von ERK1/2 und Yaz/Taz deutlich, wohingegen das Fehlen von Rac1-wt in Ma-Mel-86c-Zellen keinen merklichen Effekt auf diese Signalproteine hatte. Unsere Studien zeigten ebenfalls eine signifikant erhöhte Aktivitäten der PAK-Familie in UKE-Mel-55b-Zellen im Vergleich zu Ma-Mel-86c-Zellen. Dies impliziert das die PAK-Proteine als wichtige Effektoren bei der verstärkten Zellproliferation stromabwärts von Rac1-P29S fungieren könnten. Im zweiten Teil konzentrierten wir uns auf die Rolle von Rac1-P29S beim Erwerb der BRAFInhibitorresistenz in Melanomzellen und untersuchten mögliche Auswirkungen auf die damit verbundenen Signalwege. Insgesamt legen unsere Proliferationsstudien nahe, dass die Expression von Rac1-P29S in Melanomzellen einen Vorteil bei der Proliferation im Vergleich zu Rac1-wt bietet. Während die Proliferationsrate in Rac1-wt Zellen während der Behandlung mit dem BRAFInhibitor (PLX-4032) stark verringert blieb, konnten wir in Rac1-P29S exprimierenden Zellen eine deutliche Erholung der Proliferation in Rac1 messen. Interessanterweise ging die Aktivität des MAPK-Proteins ERK1/2 in Rac1-wt Zellen nach PLX-4032-Behandlung vollständig verloren, während ein erhebliches Restaktivitätsniveau in der Rac1-P29S-Zelllinie gemessen wurde. Darüber hinaus führte die Depletion von Rac1-P29S zu einer weiteren Verringerung der verbleibende ERK1/2-Aktivität, was ebenfalls darauf hinweist, dass die endogene Expression dieser Rac1-Variante im Melanomzellen die ERK1/2-Aktivierung während der Behandlung mit BRAF-Inhibitoren stimuliert. Zusätzlich führte die BRAF-Hemmung zu einer erhöhten nuklearen Yap/Taz-Lokalisierung in beiden Zelllinien. Die Depletion von Rac1-P29S reduzierte diesen Effekt jedoch signifikant, was darauf hindeutet, dass die Mutante die Aktivität dieser Transkriptionskoaktivatoren bei BRAF-Hemmung fördert. Eine verstärkte Bildung von Stressfasern nach PLX4032-Behandlung in beiden Melanomzelllinien deutete darauf hin, dass neben Rac1-P29S auch weitere Rho-GTPases, welche die Kontraktilität regulieren, an dem Erwerb der Arzneimittelresistenz beteiligt sein könnten. Während die Bildung von Stressfasern typischerweise mit RhoA assoziiert ist, legen unsere vorläufigen Ergebnisse unter Verwendung von RNAi und dem C3-Inhibitor nahe, dass die Aktivitäten von RhoB und RhoC in diesem zellulären Kontext funktionell relevanter sein könnten. Zusammengenommen haben unsere Ergebnisse eine stimulierende Rolle der Rac1-P29S Mutation bei der tumorbedingten Zellproliferation festgestellt und unser Verständnis erweitert, wie diese Mutation die Resistenz gegen BRAF-Inhibitoren bei Melanompatienten fördern könnte. Die gezielte Hemmung der nachgeschalteten Signalwege der Rac1-P29S-Mutation könnte daher die Entwicklung neuer pharmakologischer Behandlungsstrategien für Melanompatienten ermöglichen.

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