Chemoproteomics as a versatile approach for the study and identification of the target enzymes of neratinib in Arabidopsis thaliana
Chemoproteomics is a powerful method for the study and identification of enzymes. This method is based on the employment of a chemical probe which is made up of a small molecule inhibitor linked to a reporter group. As the inhibitory unit, in most cases a covalent-acting molecule is used that mediates the binding of the chemical probe to its target enzymes and thus enables their identification. As reporter groups, fluorescent or affinity-labelled functional groups are used that realise the detection or enrichment of these target enzymes. In a second step, the enriched target enzymes can be identified by mass spectrometric analysis.
In the present work, the molecular target enzymes of the tyrosine kinase inhibitor neratinib, a pan-inhibitor of the human epidermal growth factor receptor family that binds to a conserved cysteine residue within the ATP binding site, were investigated in Arabidopsis thaliana. Neratinib was identified as an activator of the salicylic acid signalling pathway from a chemical screen with Arabidopsis seedlings, which, amongst other, mediates the resistance of plants to pathogens. To enable the identification of the target enzymes of neratinib and thus of potential new modulators of this signalling pathway, a chemical 'click' probe was used, in which the neratinib molecule was modified with an alkyne moiety as a functional group, allowing a reporter group to be introduced to the probe in a second step. After confirming the functional integrity of this probe in human HeLa cervical carcinoma cells, the probe was applied to Arabidopsis protoplasts. From this labelling, a single prominent protein band was detected, which was identified as epoxide hydrolase 7 (AtEH7) by in-gel digestion and subsequent mass spectrometric analysis. AtEH7 was furthermore detected as a specific target enzyme of neratinib in Arabidopsis seedlings. The covalent binding of neratinib to AtEH7 was confirmed by expression of the recombinant protein in Escherichia coli, which was used for enzyme kinetic studies and labelling with the neratinib-based probe. To identify the binding site of neratinib to AtEH7, site-directed mutagenesis of all three cysteine residues was performed after a competition experiment with iodoacetamide demonstrated cysteine residues as potential binding sites of the neratinib-based probe. The resulting AtEH7 mutants were likewise screened using enzyme kinetic assays and chemical probe labelling, which permitted the validation of Cys186 as the binding site of neratinib.Die Chemoproteomik ist eine vielseitig einsetzbare Methode für das Studium und die Identifikation von Enzymen. Diese Methode beruht auf der Verwendung von sogenannten chemischen Sonden, die aus einem niedermolekularen Inhibitormolekül bestehen, welches mit einer Reportergruppe verknüpft ist. Als Inhibitoreinheit wird meist ein kovalenter Hemmstoff ausgewählt, welcher eine Bindung der chemischen Sonde an dessen Zielenzyme vermittelt und auf diese Weise deren Identifikation ermöglicht. Als Reportergruppe finden fluoreszente oder affinitätsmarkierte funktionelle Gruppen Anwendung, welche die Detektion oder Anreicherung dieser Zielenzyme realisieren. Angereicherte Zielenzyme können in einem zweiten Schritt mittels massenspektrometrischer Untersuchungen identifiziert werden.
In der vorliegenden Arbeit wurden die molekularen Zielenzyme des Tyrosinkinase-Hemmers Neratinib, einem pan-Inhibitor der humanen epidermalen Wachstumsfaktor Rezeptor-Familie, der an einen konservierten Cysteinrest innerhalb der ATP-Bindestelle bindet, in Arabidopsis thaliana untersucht. Neratinib wurde im Zuge eines chemischen Screens mit Arabidopsis-Keimlingen als Aktivator des Salicylsäure-Signalwegs, der unter anderem die Resistenz von Pflanzen gegen Pathogene vermittelt, identifiziert. Um die Zielenzyme von Neratinib und somit mögliche neue Modulatoren dieses Signalwegs zu identifizieren, wurde eine chemische ’click‘ Sonde verwendet, bei der das Neratinib-Molekül mit einem Alkinrest als funktionelle Gruppe modifiziert wurde, sodass in einer zweiten Reaktion eine Reportergruppe eingebracht werden kann. Nach Verifizierung der funktionellen Integrität dieser Sonde in humanen HeLa Gebärmutterhals-Krebszellen wurde diese in Arabidopsis-Protoplasten eingesetzt. Dabei wurde eine einzige prominente Proteinbande detektiert, die nach einem in-Gel-Verdau und massenspektrometrischer Analyse als Epoxid Hydrolase 7 (AtEH7) identifiziert wurde. AtEH7 wurde weiterhin als spezifisches Zielenzym von Neratinib in Arabidopsis-Keimlingen nachgewiesen. Die kovalente Bindung von Neratinib an AtEH7 wurde mittels Expression des rekombinanten Proteins in Escherichia coli und anschließender enzymkinetischer Untersuchungen sowie Markierungsstudien mit der Neratinib-basierten Sonde bestätigt. Zur Identifizierung der Bindestelle von Neratinib an AtEH7 wurde ferner eine ortsspezifische Mutagenese der drei vorhandenen Cysteinreste durchgeführt, nachdem eine Inhibition der Markierung von AtEH7 mit der Neratinib-basierten Sonde durch eine Vorinkubation mit dem Cystein-Alkylierungsreagenz Iodoacetamid gezeigt werden konnte. Die generierten AtEH7 Mutanten wurden ebenfalls mittels enzymkinetischer Assays und Markierungsstudien mit der chemischen Sonde überprüft, wodurch Cys186 als Bindestelle von Neratinib validiert werden konnte.