Calciumphosphat-Nanopartikel als genetisch aktive Beschichtung für Cochlea-Implantat-Elektroden

Wey, Daniela Karolin GND

In der vorliegenden Arbeit wurden Calciumphosphat-Nanopartikel als genetisch aktive Beschichtungen für Cochlea-Implantat-Elektroden untersucht. Dazu wurden zunächst Calciumphosphat-Nanopartikel synthetisiert und diese im Anschluss mittels drei verschiedener Beschichtungsmethoden auf Modellsubstrate und Cochlea-Implantate aufgebracht. Durch Zellkulturexperimente an HeLa-Zellen wurde die genetische Aktivität der Beschichtungen untersucht. In der Nanomedizin ist die gezielte Adressierung von Zellen und der Transport von Biomolekülen wie DNA oder siRNA von großem Interesse. Dadurch können Gene exprimiert oder stummgeschaltet werden, wodurch Proteinkonzentrationen reguliert werden können. Dazu wurden Nanopartikel mit Biomolekülen funktionalisiert, um diese so über die Zellmembran transportieren zu können. Die Biodistribution der Nanopartikel ist dabei entscheidend für den therapeutischen Erfolg. Um die Biodistribution auf den Zielort im Körper zu begrenzen und eine verzögerte Freisetzung der Biomoleküle zu erreichen, können Implantate mit verschiedenen Methoden beschichtet werden. Holmes et al. beschichteten 3D PLGA-Scaffolds im LbL-Verfahren mit EGFP codierender Plasmid-DNA und siedelten Zellen auf diesen an. Sie konnten zeigen, dass die Zellen auf den Scaffolds die Gene exprimierten. Kovtun et al. konnten zeigen, dass Zellen auf EPD-beschichtete Substrate mit CaP-Nanopartikeln proliferierten und transfiziert wurden. Calciumphosphat-Nanopartikel sind biokompatibel und biodegradierbar. Sie lassen sich mit DNA funktionalisieren und können diese über die Zellmembran transportieren, sodass die Gene exprimiert werden. Hier wurden entsprechend der späteren Anwendung als Beschichtung Nanopartikel sowohl mit positiven (PEI) als auch mit negativen Zeta-Potential (CMC) synthetisiert. Die dreischaligen Partikel besaßen einen Kerndurchmesser von etwa 160 nm und ein Ca:DNA-Verhältnis von 1,6 (PEI) bzw. 1,3 (CMC). In Zellversuchen mit Rhodamin-markierten CaP-Partikeln konnte gezeigt werden, dass sowohl PEI- als auch CMC-stabilisierte Partikel von den Zellen aufgenommen werden. Durch die Funktionalisierung der Partikel mit der Plasmid-DNA pcDNA3.3EGFP, wurde in Transfektionsuntersuchungen gezeigt, dass die Partikel genetisch aktiv waren. Die Beschichtung der Substrate wurde anhand drei verschiedener Methoden durchgeführt. Dazu wurden EPD, LbL und Zentrifugation angewendet. Ziel dabei war es, eine hohe Masse an Partikeln abzuscheiden und eine gleichmäßige Beschichtungen zu erhalten. Dabei sollte die sphärische Morphologie der Partikel und deren genetische Aktivität erhalten bleiben. Die Beschichtungen mittels Zentrifugation wurden mit verschiedenen Dispersionsmedien durchgeführt. Die Partikel wurden ohne Aufreinigung direkt nach der Synthese oder nach der Aufreinigung redispergiert in Reinstwasser, Ethanol oder Isopropanol durchgeführt. Dabei waren die Beschichtungseffizienten der unaufgereinigten und der in Isopropanol redispergierten Partikel am höchsten, wohingegen wässrig und ethanolisch redispergierte Partikel nur im geringen Maße auf der Oberfläche aufgebracht werden konnten. Aus den REM-Aufnahmen der Beschichtungen aus wässrig dispergierten Partikeln ging hervor, dass diese stark inhomogen waren. In der Mitte des Substrats betrug der Bedeckungsgrad etwa 6 - 34 %, am Rand hingegen konnten dichte Schichten an Partikeln und eine Bedeckung von bis zu 95 % gefunden werden. Aufgrund dieser inhomogenen Partikelverteilung eignet sich die Zentrifugation nicht als Beschichtungsmethode. Darüber hinaus besitzen die Implantate, die hier verwendet wurden, parallel auf beiden Seiten des Silikonschlauches Elektroden. Demnach ist es nicht möglich, alle Platinkontakte gleichzeitig durch Zentrifugation zu beschichten. Bei der LbL-Beschichtung wurden Polyelektrolyt-Multilagen aufgebracht. Dazu wurden nach Zhang et al. alternierende Schichten aus PLL und CMC-stabilisierten Calciumphosphat-Nanopartikeln auf Deckgläser aufgetragen. Insgesamt wurden bis zu sechs Schichten CaP aufgetragen und die Beschichtungen schichtweise untersucht. Diese Methode ermöglichte eine hohe Kontrolle bezüglich der aufgetragenen Masse, da diese linear mit der Schichtzahl anstieg. Dabei konnte mit steigender Schichtzahl die Hydrophilie der Probe erhöht werden. In Strömungspotential-Messungen wurde gezeigt, dass das PLL die Partikel in der Beschichtung erfolgreich umladen konnte. In REM-Aufnahmen wurde gezeigt, dass die Partikel ihre sphärische Morphologie während der Beschichtung beibehalten und eine gleichmäßige Bedeckung von bis zu 97 % erreicht wurde. Die elektrochemische Charakterisierung der LbL-beschichteten Cochlea-Implantate zeigte, dass die Beschichtung weder die Kapazität noch die Ohm’schen Widerstände der Implantate veränderte. In Zellversuchen an HeLa-Zellen konnte demonstriert werden, dass die Beschichtungen zytokompatibel und genetisch aktiv waren. Diese Beschichtungsart eignet sich somit potenziell für den Einsatz an Cochlea-Implantaten. Bei der EPD wurden die Partikel zum einen in Reinstwasser, zum anderen in Isopropanol dispergiert. Als Substrate wurden hierfür ITO, Silicium und Platinblech verwendet und jeweils für 15 bis 60 min beschichtet. Bei der Abscheidung aus Reinstwasser wurde eine Spannung von 2 V angelegt. Bei dieser Abscheidung konnten nur geringe Massen an CaP abgeschieden werden. Die REM-Aufnahmen zeigten, dass die Substrate nicht vollständig bedeckt wurden. Dennoch konnte die Hydrophilie der Oberfläche durch die Beschichtung erhöht werden. Aufgrund der geringen abgeschiedenen Masse an CaP eignete sich diese Methode nicht dazu, Cochlea-Implantate so zu beschichten, dass eine ausreichende genetische Aktivität zu erwarten war. Die EPD aus Isopropanol wurde mit einer Spannung von 50 V durchgeführt. Da dadurch die Wanderungsgeschwindigkeit der Partikel erhöht wurde, konnten hierbei die abgeschiedene Masse an CaP deutlich gesteigert werden. Den REM-Aufnahmen war zu entnehmen, dass die Morphologie der Partikel erhalten blieb und eine Bedeckung von bis zu 100 % erreicht wurde. Dabei waren alle Substrate mit dicken Schichten an Partikeln beladen, auf ITO und Silicium waren diese jedoch von Trocknungsrissen durchzogen. Die elektrochemische Charakterisierung der EPD-Beschichtungen auf Cochlea-Implantaten ließ darauf schließen, dass die Beschichtung die Kapazität der Implantate nicht beeinflusste. Da die Beschichtungen zu dick waren, um daran Zellversuche mittels CLSM durchzuführen, wurde die Proliferation mittels REM untersucht. Die REM-Aufnahmen zeigten vitale Zellen auf der Beschichtung. In Transfektionsuntersuchungen an einer Modellbeschichtung, die durch Auftropfen der Partikel auf Deckgläser hergestellt wurde, konnte gezeigt werden, dass die genetische Aktivität der Partikel in der Beschichtung erhalten blieb. Die Anwendung dieser Beschichtungsmethode für Cochlea-Implantate erscheint somit als ein vielversprechender Ansatz. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass die Beschichtungen mittels Zentrifugation und die EPD aus Reinstwasser ungeeignet sind, um gleichmäßige genetisch aktive Beschichtungen zu generieren. Die Beschichtung mittels LbL-Verfahren ermöglicht ein hohes Maß an Kontrolle bezüglich der aufgebrachten Menge an CaP, benötigt jedoch eine lange Präparationszeit in mehreren Arbeitsschritten. Die Methode, die sich hier als die vielversprechendste erwiesen hat, ist die EPD aus Isopropanol. Um die Eignung dieser Beschichtungen für den Einsatz im Innenohr zu prüfen, müssen Versuche an primären Innenohrzellen durchgeführt werden. Für die Beschichtung auf Cochlea-Implantaten sind Plasmide von Interesse, die neuronale Wachstumsfaktoren wie BDNF oder NT-3 codieren. Diese dienen als Lockstoffe für die Neuronen und sollen in der hier gewünschten Anwendung die Verbindung des Implantats mit dem Hörnerv verbessen. Für Zellversuche an primäre Zellen eignen sind somit die SGC, das Corti-Organ und Fibroblasten. Die Proteinkonzentrationen der neuronalen Wachstumsfaktoren lassen sich dabei mittels Western Blot und ELISA bestimmen. Das zielgerichtete Wachstum der neuronalen Zellen durch diese Proteine konnte von Li et al. gezeigt werden. Dabei beschichteten sie die Implantate mit hohlen CaP-Nanosphären, die mit dem Protein GDNF (glia cell line-derived neurotrophic factor) funktionalisiert waren. Das hier vorgestellte System könnte diese Effekte über längere Zeiträume ermöglichen, da die Transfektion der Zellen über einen längeren Zeitraum zur Expression von Proteinen führen kann. In the present work, calcium phosphate nanoparticles were investigated as genetically active coatings for cochlear implant electrodes. First, calcium phosphate nanoparticles were synthesized and then applied to model substrates and cochlear implants using three different coating methods. The genetic activity of the coatings was investigated by cell culture experiments on HeLa cells. In nanomedicine, the targeted addressing of cells and the transport of biomolecules such as DNA or siRNA is of great interest. For this purpose, nanoparticles can be functionalized with biomolecules in order to transport them across the cell membrane. The biodistribution of the nanoparticles is crucial for therapeutic success. In order to limit the biodistribution to the target site within the body and to achieve a sustained release of the biomolecules, implants can be coated using various methods. Holmes et al. coated 3D PLGA scaffolds in the LbL process with plasmid DNA encoding EGFP and colonized cells on them. They were able to show that the cells on the scaffolds expressed the genes. Kovtun et al. were able to show that cells proliferated and transfected on EPD-coated substrates with CaP nanoparticles. Calcium phosphate nanoparticles are biocompatible and biodegradable. They can be functionalised with DNA and can transport it across the cell membrane, so that the genes are expressed. Here, nanoparticles with both positive (PEI) and negative zeta potential (CMC) were synthesised depending on the later application in the form of a coating. The triple-shell particles had a core diameter of about 160 nm and a Ca:DNA ratio of 1.6 (PEI) or 1.3 (CMC). In cell experiments with rhodamine-labelled CaP particles it could be shown that both PEI and CMC-stabilized particles were taken up by the cells. By functionalizing the particles with the plasmid DNA pcDNA3.3EGFP, transfection studies showed that the particles were genetically active. The coating of the substrates was carried out using three different methods. To this end EPD, LbL and centrifugation were employed. The aim was to deposit a high mass of particles and to obtain a uniform coating. The spherical morphology of the particles and their genetic activity should be preserved. Coatings by centrifugation were performed with different dispersion media. The centrifugation was carried out using dispersions without purification directly after synthesis or with previously purified particles redispersed in ultrapure water, ethanol or isopropanol. The coating efficiencies of the unpurified particles and the particles redispersed in isopropanol were highest, whereas particles redispersed in water and ethanol could only be applied to the surface to a limited extent. The SEM images of the coatings of aqueously dispersed particles showed that they were highly inhomogeneous. In the middle of the substrate the degree of coverage was about 6 - 34 %, whereas at the edges dense layers of particles and a coverage of up to 95 % could be found. Due to this inhomogeneous particle distribution, centrifugation is not suitable as a coating method. Furthermore, the implants used here have electrodes parallel on both sides of the silicone tube. Therefore, it is not possible to coat all platinum contacts simultaneously by centrifugation. Polyelectrolyte multilayers were applied in the LbL coating process. According to Zhang et al., alternating layers of PLL and CMC-stabilized calcium phosphate nanoparticles were applied to cover glasses. In total, up to six layers of CaP were applied and the coatings were examined layer by layer. This method allowed a high degree of control with regard to the mass applied, since it increased linearly with the number of layers. The hydrophilicity of the sample was increased with increasing number of layers. In flow potential measurements it was shown that the PLL was able to successfully reverse the particles charge within the coating. In SEM images it was shown that the particles maintained their spherical morphology during the coating process and a uniform coverage of up to 97 % was achieved. The electrochemical characterization of the LbL-coated cochlear implants showed that the coating did not change the capacity or ohmic resistances of the implants. Cell experiments on HeLa cells demonstrated that the coatings were cytocompatible and genetically active. This type of coating is therefore potentially suitable for use on cochlear implants. In the EPD the particles were dispersed in ultrapure water on one side and in isopropanol on the other. The substrates used were ITO, silicon and platinum sheet metal, each coated for 15 to 60 minutes. A voltage of 2 V was applied during EPD from ultrapure water. Only small masses of CaP could be separated in this deposition process. The SEM images showed that the substrates were not completely covered. Nevertheless, the hydrophilicity of the surface could be increased by the coating. Due to the low mass of CaP deposited, this method was not suitable for coating cochlear implants in such a way that sufficient genetic activity could be expected. The EPD from isopropanol was performed with a voltage of 50 V. Since this increased the velocity of the particles, the deposited mass of CaP could be increased significantly. The SEM images showed that the morphology of the particles was preserved and a coverage of up to 100 % was achieved. All substrates were loaded with thick layers of particles, but on ITO and silicon these were interspersed with drying cracks. The electrochemical characterization of EPD coatings on cochlear implants suggested that the coating did not affect the capacity of the implants. Since the coatings were too thick to perform cell experiments on them using CLSM, proliferation was investigated by means of SEM. The SEM images showed vital cells on the coating. In transfection studies on a model coating produced by dripping the particles onto cover glasses, it could be shown that the genetic activity of the particles was retained inthe coating. The application of this coating method for cochlear implants appears to be a promising approach. In summary, it can be concluded that coatings produced by centrifugation and EPD from ultrapure water are unsuitable for generating uniform and genetically active coatings. Coating by means of the LbL process allows a high degree of control with regard to the amount of CaP applied, but requires a long preparation time in several steps. The method that has proven to be the most promising here is EPD from isopropanol. In order to test the suitability of these coatings for use in the inner ear, tests must be carried out on primary inner ear cells. Plasmids encoding neuronal growth factors such as BDNF or NT-3 are of interest for coating on cochlear implants. These serve as lures for the neurons and are intended to improve the connection of the implant with the auditory nerve in the desired application. SGC, the organ of corti and fibroblasts are suitable for experiments on primary cells. The protein concentrations of the neuronal growth factors can be determined by Western blot and ELISA. The targeted growth of neuronal cells by these proteins could be shown by Li et al. They coated the implants with hollow CaP nanospheres functionalised with the protein GDNF (glia cell line-derived neurotrophic factor). The system presented here could enable these effects over longer periods of time, since transfection of the cells over a longer period of time can lead to the expression of proteins.

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Wey, D.K., 2020. Calciumphosphat-Nanopartikel als genetisch aktive Beschichtung für Cochlea-Implantat-Elektroden. https://doi.org/10.17185/duepublico/72693
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