Analyse der genomweiten Auswirkung von Veränderungen im nukleosomen-modulierenden SWI/SNF Komplex

Kalmbach, Steven Alexander GND

Der ubiquitär exprimierte SWItch//Sucrose Non-Fermenting Komplex (SWI/SNF) spielt eine bedeutende Rolle in der Verteilung der Nukleosomen im Chromatin. Dieser Komplex ist außerdem an der Kontrolle der Genexpression mittels seiner ATP-abhängigen Mechanismen in der Chromatinremodulierung beteiligt. Verschiedene Erkrankungen werden mit Mutationen in Untereinheiten dieses Komplexes assoziiert; u.a. das sehr seltene, angeborene Coffin-Siris Syndrom (CSS). An diesem Syndrom erkrankte Individuen zeigen faziale Auffälligkeiten, digitale Anomalien, sowie eine variable geistige Behinderung. Die Mehrheit der mit CSS-diagnostizierten Patienten besitzen Mutationen in ARID1B. Wir nehmen an, dass die Nukleosomenlandschaft verschiedener Zelltypen durch die Veränderungen der Untereinheiten des SWI/SNF-Komplex beeinflusst wird. Unseres Wissens nach, führten wir die erste Studie der Nukleosomenlandschaft an Patientenmaterial von Individuen mit CSS durch. Hierin haben wir die Nukleosomenlandschaft aus zellfreier DNA (cfDNA) mittels Ganzgenomsequenzierung untersucht. Außerdem analysierten wir die Nukleosomenlandschaft in CD14+ Monozyten aus betroffenen CSS-Individuen mit „Nucleosome Occupancy and Methylome Sequencing“ (NOMe-seq) und deren Transkriptionsprofile mit RNA-seq. Es wurden keine signifikanten Veränderungen der Nukleosomenlandschaft nahe der Transkriptionsstarts in den aus der cfDNA der CSS-Patienten mit ARID1B-Mutation generierten Daten gefunden. Bei der Untersuchung der Nukleosomenlandschaft spezifisch in CD14+ Monozyten der Patienten, wurden wenige genomische Regionen mit unterschiedlicher Nukleosomenbesetzung im Vergleich zu den Kontrollen gefunden. Die RNA-seq Analyse der CD14+ Monozyten der betroffenen Individuen zeigte wenige differentiell exprimierte Gene, die nicht in näherer Umgebung der identifizierten Regionen mit differentieller Nukleosomenbesetzung lagen. Insgesamt konnten wir zeigen, dass Mutationen in der humanen SWI/SNF-Untereinheit ARID1B einen geringfügigen Einfluss auf die Umgestaltung der Nukleosomenlandschaft und die Genexpression in Blutzellen besitzen. Da Blutzellen nicht das primär betroffene Gewebe in CSS darstellen, wurden in einem weiterführenden Ansatz dieser Arbeit die Effekte von knockout und knockdown spezifischer SWI/SNF Untereinheiten auf die Nukleosomenlandschaft in neuronalen Vorläuferzellen (NPC) untersucht. Mit CRISPR-Cas9 wurde die Expression von ARID1B in einem heterozygoten KO in HUES6-hESCs reduziert. Außerdem wurde mit stabil integrierten shRNAs die Expression von SMARCA2 in H9-hESCs reduziert. Beide Zelllinien wurden anschließend zu NPCs differenziert und deren Nukleosomenlandschaft analysiert. Hierbei wurden keine genomweiten Auswirkungen, jedoch einige Veränderungen der lokalen Chromatinzugänglichkeit in den ARID1B-KO- und SMARCA2-KD-NPCs identifiziert. In beiden Ansätzen wurde der Effekt auf die Genexpression untersucht und ein Einfluss dokumentiert, der signifikant mit neuronalen Stoffwechselwegen assoziiert ist.

The ubiquitously expressed SWItch/Sucrose Non-Fermenting Complex (SWI/SNF) is a key player for the regulation of nucleosome spacing. Due to its ATP-dependent role in chromatin remodelling it also tightly controls gene expression. Mutations in its subunits have been associated with a variety of diseases, including the rare, congenital Coffin-Siris Syndrome (CSS). This disorder is linked to facial abnormalities, digital anomalies as well as intellectual disability. In the majority of patients, the underlying mutation is located in the ARID1B gene of the SWI/SNF complex. We hypothesise, that the nucleosomal landscape of various cell types is influenced by alterations of subunits of the SWI/SNF complex. To our knowledge, we executed the first study on CSS-affected individuals with the aim to analyse the nucleosomal landscape. We investigated patient-derived cell-free DNA (cfDNA) using whole genome sequencing. Furthermore, “Nucleosome Occupance and Methylome Sequencing” (NOMe-seq) was employed to assess alterations in the nucleosomal landscape of CD14+ monocytes. Also, RNA-seq was used to analyse their transcriptional profiles. No significant alterations in the nucleosomal landscape near transcription start sites were detected in the cfDNA isolated from CSS patients harbouring heterozygous ARID1B mutations. However, using the isolated CD14+ monocytes, a limited number of genomic regions showed modifications in their nucleosome occupancy when compared to control samples. Further analysis of the RNA expression profiles of those CD14+ monocyte samples revealed a few changes in RNA expression levels. None of the altered genes were located in regions previously identified to possess differential nucleosome occupancy. Overall, in this study we could show that the influence of genomic alterations in the ARID1B subunit of the SWI/SNF complex leads to minor effects on the remodelling of the nucleosomal landscape as well as the gene expression levels in blood cells. As blood cells are not the primarily affected tissue in CSS; in a second approach of this work I analysed the effect of knockout and knockdown of SWI/SNF specific subunits on the nucleosomal landscape in neural progenitor cells (NPCs). Using CRISPR-Cas9, the expression of ARID1B was reduced in a heterozygous knockout in HUES6-hESCs. Furthermore, the expression of SMARCA2 in H9-hESCs was reduced using stably integrated shRNAs. Subsequently both cell lines were differentiated to NPCs and the nucleosomal landscape was analysed. While no genome wide alterations were found, several alterations of local chromatin accessibility in ARID1B-KO and SMARCA2-KD-NPCs were identified. In both cell lines the effect on gene expression was analysed and a significant influence on neural metabolism was detected.

Cite

Citation style:
Kalmbach, S.A., 2020. Analyse der genomweiten Auswirkung von Veränderungen im nukleosomen-modulierenden SWI/SNF Komplex. https://doi.org/10.17185/duepublico/72686
Could not load citation form.

Rights

Use and reproduction:
All rights reserved

Export