Artifizielle humane Imprints
Die Etablierung von DNA-Methylierung ist ein komplexer Prozess, dessen genauer Mechanismus und die dafür notwendigen Faktoren noch nicht voll umfänglich bekannt sind. Allgemein anerkannt ist jedoch die Rolle des transkriptionellen Durchlesens als Schlüsselmechanismus für die DNA-Methylierung geimprinteter Gene, sowie der aberranten Stilllegung von Genen in bestimmten humanen Krankheitsbildern. Innerhalb dieser Arbeit wurde ein einfaches, vielseitiges, induzierbares humanes Zellkultursystem etabliert, um den Effekt des transkriptionellen Durchlesens auf beliebige, humane Promotoren zu ermöglichen. Hiermit sollten sowohl der Mechanismus als auch die notwendigen Faktoren für die Etablierung von DNA-Methylierung untersucht werden. Es wurden zwei Promotoren im Rahmen dieser Arbeit analysiert. Zum einen der Promotor des geimprinteten Gens SNRPN und zum anderen der Promotor des MSH2-Gens, welcher durch aberrantes transkriptionelles Durchlesen in Patienten mit Lynch-Syndrom methyliert wird. Da beide Promotorregionen in ihrem natürlichen Kontext durch das transkriptionelle Durchlesen eines in Tandem-orientierten Promotors beeinflusst werden, wurde diese Situation durch den starken CMV-Promotor nachempfunden. Der CMV-Promotor wird durch die Zugabe von Doxycyclin aktiviert und steuert die Expression des β-Globin-Transkriptes ocHBB2. Von den Testpromotoren erfolgt die Transkription des exon1/3-Transkriptes, welches vom endogenen, im Promotorfragment enthaltenen, Exon 1 auf das ocHBB2 Exon 3 spleißt. Mittels qRT-PCR wurde der Effekt des transkriptionellen Durchlesens des ocHBB2-Transkriptes auf die exon1/3-Expression untersucht. In allen generierten Zelllinien konnte durch die Induktion mit Doxycyclin eine Zunahme der ocHBB2-Expression beobachtet werden. Zeitgleich wurde die exon1/3-Expression der jeweiligen Testpromotoren reduziert. Die Reduktion der Expression konnte direkt auf das transkriptionelle Durchlesen des ocHBB2-Transkriptes zurückgeführt werden, da der beobachtete Effekt nach der Beendigung der Induktion reversibel war. Die Etablierung von DNA-Methylierung konnte jedoch bei keiner der getesteten Promotorregionen beobachtet werden. Auch die Überexpression epigenetischer Faktoren wie DNMT3A2, DNMT3L und ZFP57 in Zusammenhang mit transkriptionellem Durchlesen führte nicht zur Etablierung von DNA-Methylierung, so dass weitere Faktoren wie der genomische Kontext der Promotorregionen und das Potenzial zur Differenzierung ebenfalls nötig zu sein scheinen.
The establishment of DNA methylation is a complex process whose exact mechanism and the factors required are not yet fully known. However, the role of transcriptional read-through as a key mechanism for DNA methylation of imprinted genes and aberrant silencing of genes in certain human diseases is widely recognized. Within this work a simple, versatile, inducible human cell culture system was established to enable transcriptional read-through on human promoters. The aim was to investigate both, the mechanism and the necessary factors for the establishment of DNA methylation. Two promoters were analysed in this work: the promoter of the imprinted gene SNRPN and the one of MSH2, which becomes methylated by aberrant transcriptional read-through in patients with Lynch syndrome. In their natural context, both promoter regions are influenced by transcriptional read-through of a tandem-oriented promoter. This situation was simulated by inserting the strong CMV promoter upstream of the test promoters. The CMV promoter is activated by the addition of doxycycline and controls expression of the β-globin transcript ocHBB2, including ocHBB2 exons 2 and 3. The test promoters were inserted into ocHBB2 intron 2 and contained their endogenous exon 1, which results in transcription of the exon1/3-transcript splicing from endogenous exon 1 to ocHBB2 exon 3. The effect of transcriptional read-through of the ocHBB2 transcript on exon 1/3 expression was investigated by qRT-PCR. In all generated cell lines, an increase in ocHBB2 expression was observed by induction with doxycycline. At the same time, exon1/3 expression of both test promoters was reduced. The reduction in expression could be directly attributed to transcriptional read-through of the ocHBB2 transcript, since the observed effect was reversible after the induction was stopped. However, the establishment of DNA methylation could not be observed in any of the promoter regions tested. Also, the overexpression of epigenetic factors such as DNMT3A2, DNMT3L and ZFP57 in connection with transcriptional read-through did not lead to the establishment of DNA methylation. This indicates that further factors, such as genomic context of the promoter regions and the potential for differentiation, are necessary. The system established in this work sets the basis for straight forward testing of further factors in the future.