Biochemical and functional characterization of the Pch2/ORC AAA+ assembly in controlling meiotic DNA break formation

Villar Fernandez, Maria Ascension GND

Programmed DNA double-strand break (DSB) formation followed by homologous crossover recombination is crucial to establish physical linkages between homologous chromosomes and to ensure faithful chromosome segregation during meiosis. However, the introduction of DSBs within repetitive DNA elements is a major source of genomic instability, due to the possibility of DSBs repairing by non-allelic homologous recombination (NAHR). Indeed, DSBs in such repetitive regions can cause genome rearrangements and chromosome missegregation, which is linked to several genetic disorders and birth defects in humans. In this study, we investigated how the repetitive ribosomal DNA (rDNA)-boundaries of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae, which are also at high risk of NAHR, are protected against the introduction of DSBs. Particularly, we focused on the interplay of two AAA+ ATPases, the meiosis-specific Pch2 and the Orc1 subunit of the hetero-hexameric Origin Recognition Complex (ORC; Orc1-Orc6), which are involved in the protection of the rDNA edges against DSBs. We demonstrated that in vivo Pch2 associates not only with the Orc1 subunit but also with Orc2 and Orc5, suggesting that Pch2 is able to associate with the entire ORC during meiotic G2/prophase. In addition, we reconstituted this macromolecular Pch2-ORC assembly and showed, by cross-link mass-spectrometry (XL-MS), that both the NH2-terminal domain (NTD) and the AAA+ domain of Pch2 are involved in the interaction with ORC. Moreover, we showed that deletion of the NTD of Pch2 severely impairs the interaction with ORC in vivo and in vitro and that the Pch2-AAA+ domain alone is not able to prevent rDNA-associated DSB formation. In addition, we delineated the minimal region within the NTD of Pch2 (amino acids 2-144) that is sufficient to recapitulate binding with ORC in vitro. We also identified residues within this region that are critical for establishing an association with ORC and for Pch2-Orc1 functionality at the rDNA. To understand the role of other ORC subunits in the rDNA protection against meiotic DSB formation, we developed experimental approaches to functionally deplete selected ORC members (Orc2 and Orc5). Using this system, we revealed that Pch2-Orc1 functionality at the rDNA can occur in conditions of nuclear depletion of these subunits. By performing chromatin immunoprecipitation coupled to quantitative PCR (ChIP-qPCR) we showed that the function of Pch2-Orc1 at the rDNA does not require binding of ORC to its canonical sites (i.e. origins of replication). Furthermore, we have provided evidence that a chromatin-binding module of Orc1 (the bromo-adjacent homology (BAH) domain) is necessary for Pch2-ORC binding in vivo, besides not been directly involved in the in vitro binding of these complexes. These data suggests that in vivo interaction between both AAA+ ATPases is influenced by the local chromatin environment, which might be a reflect of the ability of Orc1-BAH domain to associate with regions with specific nucleosome features and in turn, to direct Orc1/ORC to sites distinct from origins of replication, enabling recruitment of Pch2 to these sites. Altogether, the data presented in this study demonstrate a direct interaction between Pch2 and ORC and reveals that, within ORC, Orc1 might have a critical contribution to both binding and functionality of this meiotic anti-DSB system. The fact that the function of Pch2-Orc1 in locally suppressing DSBs during meiotic G2/prophase presumably does not depend on the association of ORC to origins of replication likely represents an origin-independent role of Orc1/ORC. This role is distinct from its canonical one in DNA replication and seems to indicate that during meiotic G2/prophase, Orc1/ORC is repurposed to perform a function with the meiosis-specific AAA+ ATPase Pch2.

Während des Zellteilungsprozesses Meiose ist die beabsichtigte Entstehung von DNA Doppelstrangbrüchen (DSB) und die darauffolgende homologe Crossover Rekombination essentiell, um homologe Chromosomen physisch miteinander zu verbinden und eine akkurate Verteilung der Chromosomen zu gewährleisten. Die Entstehung von DSB in repetitiven DNA Elementen ist dabei eine Hauptursache für genomische Instabilität, da die DSB durch nichtallelische homologe Rekombination (NAHR) repariert werden könnten. Innerhalb solcher repetitiven DNA Elemente können DSB zu genomischer Umordnung und Fehlverteilung der Chromosomen führen. In Bezug zum menschlichen Körper ist dies ein möglicher Auslöser für verschiedene genetische Erkrankungen oder Geburtsfehler. In dieser Studie untersuchten wir, wie die durch NAHR gefährdeten Grenzen der repetitiven ribosomalen DNA (rDNA) der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae vor der Entstehung von DSB geschützt sind. Dabei lag der Fokus insbesondere auf dem Zusammenspiel der beiden AAA+ ATPasen Pch2, ein Meiose-spezifisches Protein, und Orc1, eine Untereinheit des hetero-hexamerischen Origin Recognition Komplexes (ORC; Orc1-Orc6). Diese beiden AAA+ ATPasen sind an dem Schutz der rDNA-Grenzen vor DSB beteiligt. In vivo konnten wir nachweisen, dass Pch2 sowohl mit der Orc1-Untereinheit, als auch mit den Untereinheiten Orc2 und Orc5 verbunden ist, was darauf hindeutet, dass Pch2 mit dem gesamten OR-Komplex während der meiotischen G2/Prophase assoziiert ist. Des Weiteren rekonstruierten wir die makromolekulare Zusammenlagerung von Pch2-ORC und zeigten mittels Cross-Link Massenspektrometrie (XL-MS), dass die NH2-terminale Domäne (NTD) und die AAA+ Domäne von Pch2 an der Interaktion mit ORC beteiligt sind. Außerdem veranschaulichten wir in vivo und in vitro, dass durch die Entfernung der NTD von Pch2 die Interaktion mit ORC gravierend vermindert wird und dass die AAA+ Domäne von Pch2 alleine nicht fähig ist, die rDNA-assoziierten DSB zu verhindern. Darüber hinaus beschrieben wir in vitro die minimalste Region innerhalb der NTD von Pch2 (Aminosäuren 2- 144), die ausreichend ist, um die Verbindung mit ORC herzustellen. Abschließend identifizierten wir die Aminosäurereste innerhalb dieser Region, die für die Assoziation mit ORC und die Funktionsfähigkeit von Pch2-Orc1 an der rDNA essentiell sind. Um die Rolle anderer Untereinheiten des ORC bei der Beschützung der rDNA vor meiotischen DSB zu verstehen, entwickelten wir experimentelle Ansätze, die es uns ermöglichten, selektierte ORC-Untereinheiten (Orc2 und Orc5) aus dem Nucleus funktionell zu entfernen. Mit diesen Ansätzen konnten wir zeigen, dass die Funktionsfähigkeit von Pch2- Orc1 an der rDNA nicht beeinträchtigt ist, wenn die selektierten Untereinheiten entfernt wurden. Mittels Chromatin-Immunpräzipitation gekoppelt an quantitativer PCR (ChIP-qPCR) wiesen wir nach, dass für die Funktionsfähigkeit von Pch2-Orc1 an der rDNA die Bindung des ORC an seinen kanonischen Bindestellen (d.h. Replikationsursprünge) nicht benötigt wird. Im Zuge dessen ergeben sich Hinweise dafür, dass eine Chromatin-Bindestelle von Orc1 (bromo-adjacent homology (BAH) Domäne) für die in vivo Bindung von Pch2-ORC notwendig ist, obwohl diese nicht direkt bei der in vitro Bindung dieser Komplexe involviert ist. Die Daten deuten darauf hin, dass in vivo die Interaktion zwischen beiden AAA+ ATPasen durch die lokale Umgebung des Chromatins beeinflusst wird. Dies könnte bedeuten, dass die Orc1-BAH-Domäne die Fähigkeit besitzt, sich mit Regionen, die spezifische Nukleosom- Eigenschaften haben, zu assoziieren. Durch diese Fähigkeit wiederum könnte Orc1/ORC zu Regionen gelenkt werden, die von den Replikationsursprüngen zu unterscheiden sind, und somit die Rekruitierung von Pch2 zu diesen Regionen ermöglicht. Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass eine direkte Interaktion zwischen Pch2 und ORC vorliegt und dass die Orc1-Untereinheit einen vermeintlich wichtigen Beitrag zu der Bindung und Funktionsfähigkeit bei diesem Anti-DSB System in der Meiose leistet. Aufgrund der Tatsache, dass die Funktionstüchtigkeit von Pch2-Orc1 bei der lokalen Unterdrückung der DSB während der meiotischen G2/Prophase vermutlich nicht von der Assoziation des ORC mit den Replikationsursprüngen abhängig ist, handelt es sich hierbei um eine Replikationsursprung-unabhängige Rolle von Orc1/ ORC. Diese Rolle ist von der kanonischen bei der DNA Replikation zu unterscheiden und scheint darauf hinzudeuten, dass Orc1/ORC während der meiotischen G2/Prophase umfunktioniert wird, um eine Funktion mit der Meiose-spezifischen AAA+ ATPase Pch2 auszuführen.

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Villar Fernandez, Maria Ascension: Biochemical and functional characterization of the Pch2/ORC AAA+ assembly in controlling meiotic DNA break formation. 2020.

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