Oberflächenfunktionalisierung von ultrakleinen Goldnanopartikeln für die selektive Proteinadressierung

van der Meer, Selina Beatrice GND

Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist die Etablierung einer Synthese von Azid-funktionalisierten ultrakleinen Goldnanopartikeln, die sich durch die Klickreaktion mit Alkinen so modifizieren lassen, dass sie maßgeschneidert auf spezifische Fragestellungen der Biomedizin Anwendung finden. Hierbei kann die Arbeit in vier Meilensteine unterteilt werden, die sich chronologisch wie folgt beschreiben lassen: 1.) Etablierung einer Synthese von Azid-funktionalisierten ultrakleinen Goldnanopartikeln und der Charakterisierung des Systems. 2.) Etablierung und Überprüfung der Klickreaktion von Alkinen an der Azid-bestückten Oberfläche der ultrakleinen Goldnanopartikel. 3.) Anklicken von Fluorophoren, um ein interzelluläres Verfolgen der ultrakleinen Goldnanopartikel zu ermöglichen, und daraus resultierende Eignungsprüfung der Partikel für Anwendungen in der Biomedizin und Proteinadressierung. 4.) Demonstration der spezifischen Anwendung und Avidität des Systems durch Anklicken supramolekularer Liganden. Beim ersten Meilenstein handelt es sich um die Etablierung einer neuartigen Syntheseroute zur Darstellung von Azid-funktionalisierten ultrakleinen Goldnanopartikeln. Hierbei wurde anders als in der Literatur beschriebenen Synthesen eine neuartige Präparationsmöglichkeit von klickbaren ultrakleinen Goldnanopartikeln etabliert, da die Azid-terminierten ultrakleinen Goldnanopartikel intrinsisch durch die Verwendung des Azidgruppen tragenden Peptids in einer Eintopfsynthese hergestellt wurden. Die Bindung des Tripeptids auf der Nanopartikeloberfläche wurde durch den Einbau eines Cysteins nach dem Vorbild des Glutathions erreicht. Nach der Entfernung des freien Peptids durch Ultrafiltration konnte mithilfe von IR- und NMR-spektroskopischen Untersuchungen gezeigt werden, dass das Peptid nicht nur über den Schwefel des Cysteins an der Goldnanopartikeloberfläche gebunden vorliegt, sondern auch weiterhin azidiert ist. Die charakteristische Schwingung des Azids bei 2100 cm-1 wurde nach der Synthese nachgewiesen. Das NMR-spektroskopische Experiment TOCSY zeigte durch Korrelationen der 1H-Kerne ebenfalls ein intaktes Peptid nach der Goldnanopartikelsynthese. Mittels 1H-DOSY wurde nachgewiesen, dass die Signale des Peptids im Rahmen des Fehlers gleiche Diffusionskoeffizienten aufweisen und sich der hydrodynamische Durchmesser des Peptids nach Bildung der Partikel vergrößert. Die Quantifizierung des partikelgebundenen Liganden wurde mit der ERETIC-Methode durchgeführt. Es wurde eine Oberflächenbeladung des synthetischen Peptids von ~ 70% erreicht. Mit HRTEM-Aufnahmen der Azid-funktionalisierten ultrakleinen Goldnanopartikel wurde gezeigt, dass der Goldkern sphärischer Natur ist und der mittlere Durchmesser im Größenbereich von ~ 2 nm liegt. Der zweite Meilenstein ist der Nachweis einer erfolgreichen Klickreaktion an der Nanopartikeloberfläche. Hierzu wurde das 13C-vollmarkierte Propargylalkohol als Modellalkin an die Azid-funktionalisierten Nanopartikel geklickt. Mithilfe der NMR-Methode 13C-SOFAST-HMQC wurde nachgewiesen, dass es sich bei dem Signal bei ~ 8 ppm nach der Klickreaktion um ein Triazolproton handelt. Es wurde ebenfalls mit der Aufnahme eines gekoppelten 1H-NMR-Spektrums nachgewiesen, dass sich das Signal des Triazolprotons bedingt durch die 13C-Atome des Alkohols in ein Dublett aufspaltet. Das 1H-DOSY des Klickprodukts zeigte neben einem größer werdenden hydrodynamischen Durchmesser der Partikel, dass die Signale des geklickten Propargylalkohols genauso schnell wie die Signale des partikelgebundenen Peptids diffundieren. Mithilfe von HRTEM-Aufnahmen wurde gezeigt, dass die Klickreaktion keine signifikanten Auswirkungen auf die Größe und Form der Goldkerne hat. Den dritten Meilenstein dieser Arbeit stellt das Anklicken von Alkin-modifizierten Fluorophoren dar. Durch das Anklicken von funktionalen Molekülen an die ultrakleinen Goldnanopartikel wurde ein Anwendungsbezug des Systems hergestellt. Die Fluorophore ermöglichten das Verfolgen der Partikel in diversen Zellkulturstudien. Es stellte sich heraus, dass die Partikel im Vergleich zum gelösten Fluorophor den zellulären Eintritt bis hin zum Zellkern bewältigten. Das Anklicken von Fluorophoren mit unterschiedlichen Anregungswellenlängen demonstrierte darüber hinaus den modularen Charakter des Systems und die einfache Anpassung auf zellbiologische Untersuchungen. Die markanten UV-Vis-Banden der geklickten Fluorophore ermöglichten die spektroskopische Quantifizierung der geklickten Liganden an die Nanopartikeloberfläche, und es wurden zwischen fünf und zehn Fluorophore pro Nanopartikel kovalent gebunden. Den vierten Meilensteilen dieser Arbeit stellt das Anklicken von supramolekularen Liganden dar. Dadurch wurde untersucht, ob eine Ansteuerung von Biomolekülen möglich ist und die Avidität der supramolekularen Liganden auf diese Weise optimiert werden kann. Die Arginin- und Lysin-bindenden Pinzetten wurden an die ultrakleinen Goldnanopartikel geklickt. Nach der Charakterisierung der kolloidchemischen Parameter wurden NMR-Titrationen mit diesem System durchgeführt. Die Titration mit 13C-15N-Lysin zeigte, dass die Pinzetten auf der Goldnanopartikeloberfläche intakt sind und weiterhin als Lysinbinder fungieren. Die NMR-Titration mit dem 13C-15N-Modellprotein verdeutlichte, dass Lysine und Arginine von den Pinzetten funktionalisiert an den Partikeln weiterhin angesteuert werden. Die Bindungsaffinität des Systems wurde mit einem für die Krebsforschung relevanten Protein untersucht. Die Bindungskonstante der funktionalisierten Partikel ist nahezu identisch mit der gelösten Pinzette. Eine signifikante Erhöhung der Affinität der Pinzetten durch die Bindung an die ultrakleinen Goldnanopartikel wurde nicht beobachtet. Die Ergebnisse dieser Arbeit verdeutlichen, dass die Oberflächenfunktionalisierung von ultrakleinen Goldnanopartikeln ein maßgeschneidertes Transportvehikel im Bereich der Biomedizin ermöglicht. Nach der Klickreaktion wird ein kolloidal stabiles System erhalten, das sich weiterhin durch ultrakleine Goldsphären und eine funktionsfähige Ligandenhülle auszeichnet. Neben der Oberflächenfunktionalisierung von ultrakleinen Goldnanopartikeln mittels der Klickchemie wurde im Rahmen dieser Arbeit die peptidmimetischen Oligoamidoamine der Arbeitsgruppe Hartmann als Ligandenklasse für ultrakleine Goldnanopartikel untersucht. Die Oligoamidoamine zeichnen sich neben den hydrophilen EDS-Bausteinen durch mehrere Cysteine aus. Die freien Thiolgruppen der Cysteine sorgen für die Bindung der Präzisionsmakromoleküle an der Nanopartikeloberfläche. Anhand von SAXS und HRTEM wurde gezeigt, dass bi- und hexavalente Makromolekülliganden ultrakleine Goldnanopartikel stabilisieren. Die erhaltenen Partikelgrößenverteilungen sind sehr schmal und weisen auf monodisperse Proben hin. Die NMR-spektroskopischen Untersuchungen zeigten, dass die Partikel-gebundenen Makromoleküle nach der Synthese intakt sind und die 1H-Resonanzen der Cysteine so breit werden, dass sie als Signal in den Spektren nicht mehr nachweisbar sind. Die starke Signalverbeiterung der Bindungsbausteine verdeutlichen, dass die Multithiol-Liganden multivalent an der Nanopartikeloberfläche binden. 1H-DOSY-Experimente veranschaulichen, dass sich die Partikel-gebundenen Makromoleküle um den Goldkern koordiniert befinden, da ein erheblicher Zuwachs der hydrodynamischen Durchmesser von über ~ 50% zu verzeichnen war. Dies zeigt jedoch auch, dass die Multivalenz der Liganden keine Quervernetzung zu benachbarten Goldkernen hervorruft. Die Quantifizierung der Partikel-gebundenen Makromoleküle bestätigte die Annahme, dass sich der Funktionalisierungsgrad der Partikel durch die hier vorgestellten Multithiol-Liganden einstellen lässt. Die Ergebnisse sind zukunftsweisend und offenbaren, dass Multithiol-Oligoamidoamine eine interessante und fortschrittliche Molekülklasse für die Funktionalisierung von ultrakleinen Goldnanopartikeln darstellen. Vor allem eine Monofunktionalisierung der Partikel mit einem Multithiol-Makromolekül würde die Handhabung der Partikel enorm vereinfachen, da als Ergebnis ein Nanopartikelsystem mit einer definierten Größe, Form und einem Liganden pro Partikel zu erwarten ist.

The aim of the present work is the establishment of a synthesis of azide-functionalized ultrasmall gold nanoparticles that can be modified by the click reaction with alkynes in such a way that these can be tailored to specific biomedical questions. The work can be divided into four milestones, describing each milestone chronologically as follows: 1.) Establishment of a synthesis of azide-functionalized ultrasmall gold nanoparticles and characterization of the system. 2.) Establishment and verification of the click reaction of alkynes on the azide-tipped surface of the ultrasmall gold nanoparticles. 3.) Clicking of fluorophores to enable intercellular tracking of the ultrasmall gold nanoparticles and the resulting qualification testing of the particles for applications in biomedicine and protein control. 4.) Demonstration of the specific application and avidity of the system by clicking of supramolecular ligands. The first milestone was the establishment of a novel synthesis route for the synthesis of azid-functionalized ultrasmall gold nanoparticles. Beyond the synthesis described in literature, a novel method for the preparation of clickable ultrasmall gold nanoparticles has been established, because the azide-terminated ultrasmall gold nanoparticles were intrinsically produced by using the azide-modified peptide in a one-pot synthesis. The binding of the tripeptide to the nanoparticle surface was achieved by the incorporation of a cysteine following the model of a glutathione structure. After the removal of the free peptide by ultrafiltration, IR and NMR spectroscopic investigations showed that the peptide is not only bound to the gold nanoparticle surface by the sulfur but is also further acidified. The characteristic azide vibration at 2100 cm-1 was detected after synthesis. Further, the NMR spectroscopic experiment TOCSY showed an intact peptide after gold nanoparticle synthesis by correlating the 1H nuclei. Using 1H-DOSY, it was demonstrated clearly that the signals of the peptide have the same diffusion coefficients and the hydrodynamic diameter of the peptide increases after formation of the particles. The quantification of the particle-bound ligand was performed using the ERETIC method. A surface loading of the synthetic peptide of ~ 70% was observed. The HRTEM images of the azide functionalized ultrasmall gold nanoparticles confirmed a spherical gold core with a mean diameter in the ~ 2 nm dimension range. The second milestone was to show evidence of a successful click reaction onto the nanoparticle surface. The 13C labelled propargyl alcohol was clicked onto the azide-functionalized nanoparticles as a model alkyne. Using the NMR method 13C-SOFAST-HMQC, it was shown that the signal at ~ 8 ppm after the click reaction is a triazole proton. It was also determined that with the inclusion of a coupled 1H-NMR spectrum, the signal of the triazole proton splits into a doublet resulting from the 13C-atoms of the alcohol. The 1H-DOSY of the click product showed that the signals of the clicked propargyl alcohol diffuse as fast as the signals of the particle bound peptide. Using HRTEM images, it has been demonstrated that the click reaction has no significant effect on the size and shape of the gold core. The third milestone of this work was the clicking of alkyne-modified fluorophores. By clicking functional molecules to the ultrasmall gold nanoparticles, an applied aspect of the system was obtained. The fluorophores enabled the tracking of the particles in various cell culture studies. It was found that in comparison to the dissolved fluorophore, the particles managed the cellular entry down to the cell nucleus. In addition, clicking of fluorophores with different excitation wavelengths demonstrated the modular character of the system and the easy adjustment to cell biological investigations. The UV-vis bands of the clicked fluorophores allowed the spectroscopic quantification of the clicked ligands on the nanoparticle surface and between 10 and 5 fluorophores per nanoparticle were covalently bound. The fourth milestone of this work was the clicking of supramolecular ligands. By clicking these ligands, the possibility of targeting biomolecules and optimizing the avidity of supramolecular ligands was investigated. The arginine and lysine-binding tweezers were clicked onto the ultrasmall gold nanoparticles. After the characterization of the colloidal-chemical parameters, NMR titrations were carried out with this system. Titration with 13C-15N lysine showed that the clicked tweezers were intact and still acted as lysine binders. NMR titration with the 13C-15N model protein showed that the tweezer bound to the gold surface addressed lysines and arginines. The binding affinity of the system was investigated with a protein that is relevant for cancer research. The binding constant of the functionalized particles was almost identical to that of the dissolved tweezers. A significant increase in the affinity of the tweezers by binding it to the ultrasmall gold nanoparticles was not observed. The results of this work indicate that the surface functionalization of ultrasmall gold nanoparticles provides a tailor-made transport vehicle in the field of biomedicine. After the click reaction, a colloidally stable system is obtained that is characterized by ultrasmall gold cores and a functional ligand shell. Besides the surface functionalization of ultrasmall gold nanoparticles by the click chemistry, the peptide mimetic oligo(amidoamine) of Hartmann group was investigated as a ligand class for ultrasmall gold nanoparticles. In addition to the hydrophilic EDS building blocks, the oligo(amidoamine)s are characterized by several cysteines. The free thiol groups of the cysteines are responsible for binding the precision macromolecules to the nanoparticle surface. SAXS and HRTEM showed that bi- and hexavalent macromolecules stabilize ultrasmall gold nanoparticles. The obtained particle size distributions are very narrow and indicate monodisperse samples. NMR spectroscopic investigations showed that the particle-bound macromolecules are intact after synthesis and the 1H resonances of the cysteines become so broad that they are no longer traceable as signals in the spectra. The strong enhancement of the binding building blocks indicates that the multi-thiol ligands bind multivalently to the nanoparticle surface. 1H-DOSY experiments clearly show that the particle-bound macromolecules are coordinated around the gold core, with significant increases in hydrodynamic diameters of over ~ 50%. However, it also clarifies that the multivalence of the ligands does not generate cross-linking to other gold nuclei. The quantification of the particle-bound macromolecules confirmed the assumption that the functionalization state of the particles can be controlled by the multi-thiol ligands described here. The results are promising and suggest, that multi-thiol oligo(amidoamine) present an interesting and advanced class of molecules for the functionalization of ultrasmall gold nanoparticles. Especially a mono-functionalization of the particles with a multi-thiol macromolecule would simplify the handling of the particles enormously, because a resulting nanoparticle system with a defined size, shape and one ligand per particle can be assumed.

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van der Meer, S.B., 2020. Oberflächenfunktionalisierung von ultrakleinen Goldnanopartikeln für die selektive Proteinadressierung. https://doi.org/10.17185/duepublico/72219
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