The role of hypoxia-inducible factors (HIFs) in a mouse model of colorectal cancer

Schützhold, Vera GND

Hypoxie ist ein typisches Charakteristikum für Entzündungsherde und solide Tumoren und löst eine Zellantwort auf Genexpressionsebene aus, die von Transkriptionsfaktoren kontrolliert wird, die Hypoxie-induzierbare Faktoren (HIFs) genannt werden. HIFs werden von Prolylhydroxylasen und einer Asparaginylhydroxylase namens FIH (factor-inhibiting HIF) reguliert. Kolorektales Karzinom ist die am vierthäufigsten auftretende Krebsart mit tödlicher Folge weltweit und kann durch chronisch entzündliche Darmerkrankungen wie Colitis Ulcerosa begünstigt werden. Es wird vermutet, dass FIH als Tumorsuppressor bei der Entstehung kolorektaler Karzinome durch Hemmung des HIF-1-Signalwegs wirken kann. Andererseits führt die Stabilisierung von epithelialem HIF zu einer schwächeren Entzündungsreaktion der akuten Colitis im Mausmodell. In dieser Arbeit wurde die Bedeutung von epithelialem FIH in einem Mausmodell für ein Colitis-assoziiertes kolorektales Karzinom untersucht. Chronische Darmentzündung mit darauffolgendem Darmkrebs wurde durch Verwendung des Onkogens Azoxymethan (AOM; 10 mg/kg Körpergewicht, intraperitoneal) und Verabreichung von Dextrannatriumsulfat (DSS; 1,5% im Trinkwasser) bei FIHfl/fl (wildtyp) und FIHfl/flxVillinCre (FIH knockout im Dickdarmepithel) Mäusen induziert. Die Tiere wurden zweimal mit AOM und zweimal in einem 5-Tages-, einmal in einem 4-Tageszyklus mit DSS behandelt. Dazwischen lagen Regenerationszeiten von zwei Wochen. In einem zusätzlichen Experiment wurde der Pan-Hydroxylaseinhibitor Dimethyloxalylglycin (DMOG) während der DSS-Phasen eingesetzt. Der Disease Activity Index (DAI) wurde aufgezeichnet, welcher den Gewichtsverlust, die Stuhlkonsistenz und das Ergebnis eines Hämoccult-Tests berücksichtigt. Außerdem wurden Proben für molekularbiologische Analysen entnommen. Interaktionsanalysen zwischen FIH und seinem Substrat HIF wurden mithilfe von Co-Immunopräzipitation (Co-IP, in vitro) und FRET-Messungen (in vivo: Zellkultur) durchgeführt. Co-IP mit Fluorophor-markiertem HIF-1α und FIH zeigte die Proteininteraktion in vitro und die Eignung der Konstrukte für in vivo Messungen. FRET-Messungen wurden in zwei unterschiedlichen Systemen durchgeführt: seFRET und FLIM und bestätigten teilweise die Proteininteraktion in lebenden Zellen. Das Mausmodell für Colitis-assoziierte kolorektale Karzinome, in dem bei den Mäusen ein ~70%iger FIH knockout in mRNA aus Gesamtdarmproben festgestellt wurde, zeigte, dass AOM-DSS-behandelte Tiere im Vergleich zu unbehandelten Kontrolltieren Tumore entwickelten. Zwischen FIHfl/fl- und FIHfl/flxVillinCre-Tieren waren keine Unterschiede in der Anzahl der Tumore zu beobachten. Jedoch zeigten die FIHfl/fl-Mäuse einen höheren DAI verglichen mit FIHfl/flxVillinCre-Mäusen in der letzten DSS-Phase unter DMOG-Behandlung. Außerdem zeigten die AOM-DSS-DMOG-behandelten FIHfl/fl-Tiere mehr infiltrierte Makrophagen im Darm als FIHfl/flxVillinCre-Tiere derselben Behandlungsgruppe. Zusätzlich identifizierten RNAseq-Analysen eine Anreicherung von gene ontology Termen, die mit der Immunantwort assoziiert sind. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass der FIH knockout im Kolonepithel die Entzündungsreaktionen während chronischer Colitis vermindert, was durch Behandlung mit einem chemischen Pan-Hydroxylasehemmer verstärkt werden konnte.

Hypoxia is a characteristic feature of inflammation as well as of solid tumors and enforces a gene expression response controlled by transcription factors called hypoxia-inducible factors (HIFs). HIFs are regulated by prolyl hydroxylases and the asparaginyl hydroxylase factor-inhibiting HIF (FIH). Colorectal cancer is the fourth most common cause of cancer mortality worldwide and can be promoted by inflammatory bowel diseases as chronic colitis. FIH is suggested to be a tumor suppressor in colorectal cancer development by repressing the HIF 1 pathway. On the other side, epithelial HIF stabilization leads to a less severe inflammation in an acute colitis mouse model. In this work, the role of epithelial FIH in a mouse model of colitis-induced colorectal cancer was studied. We induced chronic intestinal inflammation and colon cancer by administration of the oncogene azoxymethane (AOM, 10 mg/kg body weight, i.p.) and of dextran sodium sulfate (DSS, 1.5% in the drinking water) to FIHfl/fl (wildtype) and FIHfl/flxVillinCre (FIH knockout in colon epithelial cells) mice. Animals were treated with AOM twice and with two 5-day/one 4-day phases of DSS intermitted by regeneration times of two weeks. As an additional experiment, the pan-hydroxylase inhibitor dimethyloxalylglycine (DMOG) was administered during DSS-treatment. The disease activity index (DAI) comprising weight loss, stool consistency, and (occult) fecal bleeding was recorded and samples for molecular biological analyses were taken. To study the interaction of FIH and its target HIF we used co-immunoprecipitation (co-IP, in vitro) and FRET measurements (‘in vivo’: cell culture). Co-IP with fluorophore-tagged HIF-1α and FIH proteins revealed the interaction in vitro and the usability of these constructs for in vivo measurements. FRET measurements with two different detection methods (seFRET and FLIM) confirmed partly the HIF-1α/FIH interaction in living cells. In the colitis-associated colorectal cancer mouse model (knockout efficiency of FIH ~70% for whole colon mRNA), we observed a strong tumor development in the mice treated with AOM and DSS compared to control animals. Tumor occurrence did not significantly differ between FIHfl/fl and FIHfl/flxVillinCre mice. However, the FIHfl/fl mice showed a higher DAI compared to the FIHfl/flxVillinCre mice in the last DSS phase with DMOG treatment. Additionally, AOM-DSS-DMOG-treated FIHfl/fl mice showed a higher infiltration of macrophages than FIHfl/flxVillinCre mice of the same experimental group. RNAseq analysis identified an enrichment of immune response-associated GO terms. Thus, FIH knockout in colon epithelial cells seems to ameliorate the inflammatory response in chronic colitis which is possibly enhanced by temporary chemical pan-hydroxylase inhibition.

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Schützhold, V., 2020. The role of hypoxia-inducible factors (HIFs) in a mouse model of colorectal cancer. https://doi.org/10.17185/duepublico/71948
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