Biotechnologische Anwendungen auf Basis von Enzymen oder Ganzzellkatalyse

Enzyme werden als biologische Katalysatoren seit vielen Jahren erfolgreich in Bereichen der Medizin, Biotechnologie oder verschiedenen Industriesegmenten wie der Lebensmittel- und Waschmittelindustrie eingesetzt. Die Enzym-vermittelte Beschleunigung von Reaktionen, die Substrat- und Stereospezifität sowie die einfache Produktion der Enzyme bzw. Zellen führen zur Einsparung von Zeit, Energie und damit Produktionskosten. Sowohl die Enzym-basierte Biotransformation als auch die Ganzzellkatalyse haben ihre ganz eigenen Vorteile. Das Crenarchaeon Sulfolobus acidocaldarius ist ein vielversprechender archaeller Plattformorganismus für die biotechnologische und industrielle Produktion. Aufgrund seiner Wachstumsbedingungen bei 75–80 °C und einem pH-Wert von 2–3 eignet sich dieser Organismus insbesondere zum Abbau lignocellulosehaltiger Biomasse zur Generierung verschiedener Produkte. Da die Vorbehandlung der lignocellulosehaltigen Biomasse, die Wachstumsbedingungen des Organismus und die Destillation unter sehr ähnlichen Bedingungen ablaufen, können zeit- und energieintensive Prozessschritte und damit Prozesskosten eingespart werden sowie neue „Ein-Topf-Strategien“ entwickelt werden. Das Ziel dieser Arbeit war es den Stoffwechsel durch „metabolic engineering“ und die Integration entsprechender Enzyme sowie Transportsysteme so zu verändern, dass ein Wachstum auf Cellulose möglich ist und exemplarisch Bioethanol als Produkt gebildet wird. Es konnten drei Cellulasen identifiziert werden, die nach Expression in S. acidocaldarius Aktivität gegenüber Carboxymethylcellulose zeigen, zudem war die Integration des ersten Cellulasegens ins Genom erfolgreich. Als Alternative zu einem Cellobiosetransporter konnte mit Hilfe einer extrazellulären β-Glukosidase das Wachstum auf Cellobiose, dem Abbauprodukt von Cellulose, etabliert werden. Für die Ethanolbildung wurden zwei mögliche Synthesewege untersucht und passende Enzymkandidaten identifiziert. Die entsprechenden Gene konnten in S. acidocaldarius exprimiert werden und für die bifunktionale Acetaldehyd/Alkoholdehydrogenase konnte die entsprechende Aktivität bereits bestätigt werden. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es S. acidocaldarius als Ganzzellbiosensor zu etablieren, um die bei der Vorbehandlung von Lignocellulose auftretende Bildung toxischer Nebenprodukte wie Furfural und 5-Hydroxymethylfurfural frühzeitig detektieren zu können. Hierzu wurden S. acidocaldarius-Kulturen mit Furfural- und 5-Hydroxymethylfurfuralkonzentrationen versetzt, die das Wachstum nicht beeinträchtigten und über einen Transkriptomansatz konnten geeignete induzierbare Promotoren identifiziert werden. UDP-N-Acetylenolpyruvylglucosamin-Reduktasen wurden als neuartige thermophile Reporterproteine bezüglich ihrer funktionellen Expression in S. acidocaldarius untersucht. Neben der Entwicklung eines thermoacidophilen Ganzzellsystems wurde im Rahmen dieser Arbeit ein weiterer Enzym-basierter Ansatz verfolgt, um eine neuartige Syntheseroute für phosphorylierte 2-Keto-3-desoxy-Zuckersäuren zu etablieren. 2-Keto-3-desoxy-6-phosphogluconat ist das Schlüsselintermediat des Entner-Doudoroff-Weges in vielen Organismen, einschließlich humanen und pflanzlichen Pathogenen und ist damit für die Grundlagenforschung, biotechnologische und biomedizinische Anwendungen bis hin zur Diagnostik von großer Bedeutung. Hier konnte über die rekombinante Produktion der 6-Phosphogluconat-Dehydratase aus Caulobacter crescentus ein neues Ein-Schritt-Verfahren für die effiziente biokatalytische 2-Keto-3-desoxy-6-phosphogluconat-Produktion etabliert werden.
Enzymes have been used successfully as biological catalysts for many years in the fields of medicine, biotechnology or various industrial segments such as the food and detergent industry. The enzyme-mediated acceleration of reactions, the substrate and stereospecificity as well as the simple production of the enzymes or cells save time, energy and thus production costs. Both enzyme-based biotransformation and whole-cell catalysis have their own advantages. The crenarchaeon Sulfolobus acidocaldarius is a promising archaeal platform organism for biotechnological and industrial application. Due to its growth at 75–80 °C and pH 2–3, this organism is particularly suitable for conversion of lignocellulosic biomass to generate various value-added products. Since the growth conditions of S. acidocaldarius match those of pretreatment of lignocellulosic biomass and distillation of volatile products such as bioalcohols, time- and energy consuming process steps and thus process costs can be reduced and new "one-pot strategies" can be developed. The aim of this work was to use metabolic engineering in order to integrate appropriate enzymes and transport systems into S. acidocaldarius so that growth on cellulose is possible and bioethanol can be formed as product. Three cellulases were identified that show activity with carboxymethyl cellulose after expression in S. acidocaldarius and the first cellulase gene was successfully integrated into the genome. As an alternative to a cellobiose transporter, growth on cellobiose, the degradation product of cellulose, was established with the help of an extracellular β-glucosidase. In addition, two possible synthetic routes were investigated for ethanol formation and suitable enzyme candidates were identified. The corresponding genes could be expressed in S. acidocaldarius and the corresponding activity for the bifunctional acetaldehyde/alcohol dehydrogenase could already be confirmed. Another goal of this work was to establish S. acidocaldarius as a whole cell biosensor for the early detection of toxic byproducts such as furfural and 5-hydroxymethylfurfural during the pretreatment of lignocellulose. For this purpose, S. acidocaldarius cultures were mixed with furfural and 5-hydroxymethylfurfural concentrations that did not impair growth and suitable inducible promoters could be identified using a transcriptomic approach. UDP-N-Acetylenolpyruvylglucosamine reductases were investigated as novel thermophilic reporter proteins with regard to their functional expression in S. acidocaldarius. In addition to the development of a thermoacidophilic whole cell production system, another enzyme-based approach was pursued in this work to establish a new synthetic route for phosphorylated 2-keto-3-deoxy sugar acids. 2-Keto-3-deoxy-6-phosphogluconate is the key intermediate of the Entner-Doudoroff pathway in many organisms, including human and plant pathogens, and is therefore of great importance for basic research as well as biotechnological and biomedical applications up to diagnostics. With the help of the recombinant produced 6-phosphogluconate dehydratase from Caulobacter crescentus a new one-step process for the efficient biocatalytic production of 2-keto-3-deoxy-6-phosphogluconate could be established.

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