Mesoscopic whole organ imaging using light sheet fluorescence microscopy : from experimental systems to clinical application

Cellular interactions and thus organ function and anatomy are inherently of a threedimensional nature. Knowledge of the cellular distribution patterns in organs in health and disease is key to understand ongoing microscopic processes on a mesoscopic organwide scale. However, until recently, no imaging modalities capable of imaging entire organs with cellular resolution were available. Magnetic resonance or ultrasound imaging lack resolution, whereas fluorescence-based imaging approaches typically lack tissue penetration depth. To unlock the mesoscopic scale, tissue clearing can be used to render samples optically transparent, literally allowing to see through entire intact organs. The combination of tissue clearing with specific fluorophore-conjugated antibody labeling and light sheet fluorescence microscopy (LSFM) delivers organ models with cellular resolution. In this thesis, multiple LSFM-based approaches were developed assessing various organs and models in order to characterize and explore i) anatomical alterations and the early immune response after myocardial infarction in mice, ii) the distribution patterns and role of tumor associated neutrophil granulocytes in head and neck squamous cell carcinoma and iii) the diagnostic potential of LSFM in staging melanoma patients via sentinel lymph node biopsy. In summary, this showed the vast potential of LSFM to visualize cellular distribution patterns in the context of whole organs and to extract quantitative data from the 3-D space. Furthermore, we showed the applicability of LSFM in answering both clinically and diagnostically relevant questions. In fact, LSFM analysis did not only match to 100% with gold standard histopathology but even allowed one melanoma patient to gain access to therapeutic options, which would have been denied based on gold standard histopathological analysis alone.

Zelluläre Interaktionen und damit verbundene, übergeordnete Organfunktionen haben zwangsläufig einen dreidimensionalen Charakter. Daher ist die Bestimmung von zellulären Verteilungsmustern innerhalb verschiedener Organe im gesunden wie auch im erkrankten Zustand vonnöten, um lokale zelluläre Vorgänge auf mesoskopischer Organebene zu verstehen. Die technischen Möglichkeiten gesamte Organe mit zellulärer Auflösung darzustellen waren in der Vergangenheit jedoch nicht vorhanden. Magnetresonanztomographie oder Ultraschalluntersuchungen verfügen nicht über die nötige zelluläre Auflösung, während fluoreszenz-basierte Bildgebungsverfahren eine zu geringe Eindringtiefe in Gewebe aufweisen. Um die mesoskopische Ebene zu betrachten, kann nun Gewebsklärung angewandt werden, welche biologische Proben optisch durchsichtig macht. Die Kombination dieses Verfahrens mit gerichteten Färbungen, z.B. durch Fluorophor-gekoppelte Antikörper und der sogenannten Lichtblattfluoreszenzmikroskopie (LSFM) erlaubt die Darstellung von einzelnen Zellen im Kontext intakter Organe. In dieser Arbeit wurden Verfahren zur mesoskopischen Ogananalyse durch LSFM für verschiedenste Krankheitsmodelle und Organe entwickelt. Hierbei wurden, unter anderem, die anatomischen Veränderungen wie auch die assoziierte frühe Immunantwort nach einem akuten Herzinfarkt charakterisiert. Des Weiteren konnte die Rolle von Tumor assoziierten neutrophilen Granulozyten und deren räumlich lokalisierte Verteilungsmuster in Plattenepithelkarzinomen der Mundregion genauer untersucht werden. Abschließend wurden Wächterlymphknoten von Melanom Patienten mit Hilfe des LSFM Verfahrens analysiert. Hierbei konnte das enorme diagnostische Potenzial der Methode für die postoperative Patienteneinstufung und -therapie klar belegt werden. Die Ergebnisse unterstreichen die Fähigkeit der LSFM Analyse zelluläre Verteilungsmuster im dreidimensionalen Kontext von Organen präzise zu rekonstruieren und damit quantifierbar zu machen. Darüber hinaus konnte die LSFM sowohl in der Grundlagenforschung als auch zur Beantwortung klinischer oder diagnostischer Fragen erfolgreich eingesetzt werden. Von entscheidender Bedeutung ist hierbei die Tatsache, dass die LSFM Analyse von Wächterlymphknoten nicht nur zu 100% mit dem histologischen Goldstandard übereinstimmte, sondern dass das Verfahren einem Studienteilnehmer Zugang zu Therapieoptionen ermöglichte, die ihm aufgrund der negativen histologischen Routineuntersuchung verwehrt worden wären.

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