Role of Rho GTPase networks in Keratinocyte migration
Keratinocytes are skin cells, which undergo proliferation, differentiation and migration during normal homeostasis and wound healing. Several groups have shown that the Rho GTPases Cdc42, Rho and Rac play critical role in Keratinocyte maintenance and differentiation. However, little is known about their function in Keratinocyte motility and how their subcellular activity patterns might mediate these effects. Here, a multifaceted approach was used which includes fluorescent live-cell activity sensors, TIRF microscopy, RNAi and overexpression studies to characterize spatio-temporal activity patterns of two major Rho GTPases, Cdc42 and Rho, in Keratinocytes during migration and to understand the underlying mechanisms. The work here confirmed Cdc42 to be an integral part of Keratinocyte migration machinery. First, a live cell sensor for Cdc42 activity was used revealing two major Cdc42 activity patterns during migration. In addition, Cdc42 activity pulses were observed in the lamellum region in the front of the cells as well as a more persistent Cdc42 activity pool at the trailing edge. Interestingly, the latter strongly correlated with the direction of cell migration and overlapped with the retrograde flow of actin and Myosin-II. Next, the potential regulatory mechanisms controlling Cdc42 activity patterns in migratory Keratinocytes were explored. Prior studies have revealed binding of the Cdc42/Rac1 effector PAK to the guanine nucleotide exchange factor (GEF) βPix suggesting a positive feedback loop. Using pharmaceutical inhibition and RNAi mediated depletion of PAK2 as well as βPix lead to strong decrease of the Cdc42 trailing-edge activity, further strengthening potential existence of such positive feedback loop to control Cdc42 activity patterns in Keratinocytes. Finally, depletion of Cdc42 lead to decrease in cell migration as well as to significant reduction of contraction sites. This confirms that Cdc42 is critical for Keratinocyte migration possibly via controlling actomyosin dynamics. Growth factor stimulation is a major trigger of Keratinocyte cell motility. Interestingly, EGF stimulation did not affect Cdc42 activity patterns suggesting that it is a part of intrinsic cell migration machinery, which does not rely on growth factor stimulation. In contrast to Cdc42, significantly altered Rho activity patterns were seen upon EGF stimulation. However, the changes in subcellular Rho activity signals were very transient. For example, low amplitude activity pulses in the entire cell increased within the first 12 minutes and decreased after an hour. Also, a very prominent, albeit transient, Rho activity increase around the entire cell periphery was observed shortly after EGF addition that was followed by strong contraction of these regions. Such transient global cell contraction may be required to stimulate enhanced migratory behavior, for example, by reorganizing topology of signal networks controlling Rho GTPase activity. The steep and transient rise of Rho activity upon EGF addition may be due to excitability in the system and a focused overexpression screen revealed several Rho activating Lbc type GEFs that enhanced Rho activity waves and thus might be potentially involved in Rho excitability in Keratinocytes. In the last part of the work, a previously established cell system (U2OS) was used to better understand the role of the extracellular matrix and the cellular cortex in the regulation of Rho activity. Rho activity pulses were enhanced by the ECM substrates collagen and fibronectin implicating integrin signaling linked to the pulsatory Rho network dynamics. Furthermore, our findings revealed sub-cellular localization pulses of the ERM proteins ezrin and moesin at the cell cortex that strongly correlated with actin dynamics and Rho activity pulses. Inhibition of Rho-ROCK signaling reduced ezrin pulses suggesting that ERM protein dynamics might be downstream of Rho activity and actomyosin pulses in adherent cells. Together, the work presented here revealed novel insight into the role of the Rho GTPase Cdc42 in Keratinocyte cell migration and advanced knowledge of the molecular mechanisms controlling its sub-cellular activity patterns in this process. Furthermore, our findings link growth factor induced distinct Rho activity patterns to cellular morpho-dynamics and identified potential regulatory GEFs. We are far from understanding the entire complexity of the underlying mechanisms that give rise to distinct local Rho GTPase activity patterns. Future work building on the novel findings presented in this thesis will greatly advance our understanding of Keratinocyte motility and increase the scope of therapeutics for aberrant processes related to wound healing and reepithelization.
Keratinozyten sind Hautzellen, welche während für die Aufrechterhaltung der Homöostase und die Durchführung der Wundheilung proliferieren, differenzieren und migrieren. Mehrere Gruppen zuvor haben gezeigt, dass Rho-GTPasen wichtig für die Aufrechterhaltung und Differenzierung von Keratinozyten sind. Die Funktion dieser Proteine in der Migration von Keratinozyten sowie die Bedeutung und Regulation ihrer räumlich-zeitlichen Aktivierung sind jedoch weitgehend unbekannt. Zur Untersuchung der Rolle der zwei prominenten Rho-GTPasen, Cdc42 und Rho in migrierenden Keratinozyten wurde in dieser Arbeit ein vielfältiger Ansatz verfolgt. Dieser umfasst eine Kombination aus Fluoreszenz-markierten Aktivitätssensoren für Lebend-Zell-Mikroskopie (TRIF Mikroskopie), siRNA-Depletion sowie die Anwendung von Überexpressionsstudien. Die vorliegende Arbeit zeigte zunächst, dass Cdc42 eine wichtige Rolle in der Migration von Keratinozyten einnimmt. So konnten mit Hilfe eines Fluoreszenzsensors zwei diskrete Aktivitätsmuster in migrierenden Zellen beobachtet werden. Zum einen wurden Cdc42 Aktivitätspulse im vorderen Bereich der Zellen, dem Lamellum, detektiert. Des Weiteren konnte ein sehr beständiges Cdc42 Aktivitätssignal im hinteren Bereich der Zellen beobachtet werden. Interessanterweise zeigten die letzteren Aktivitätssignale eine starke Korrelation mit der Direktionalität der Migration und eine deutliche Überlagerung mit dem retrograden Fluss von Aktin und Myosin-II in diesem Bereich. Als nächstes wurde der molekulare Mechanismus, welcher die Cdc42 Aktivitätspulse in migrierenden Keratinozyten kontrolliert, untersucht. Frühere Studien konnten die Interaktion des Cdc42 Effektors PAK mit dem Guaninnukleotid-Austauschfaktor ßPix zeigen, welcher wiederum die GTPase aktiviert und somit einen potentiellen positiven Feedback-Mechanismus erlaubt. Mit Hilfe von pharmakologischen Inhibitoren sowie der siRNA vermittelten Depletion von PAK2 und ßPix konnte in dieser Arbeit eine starke Verringerung der Cdc42 Aktivität im hinteren Teil der Zelle ermittelt werden, welche tatsächlich die Existenz eines solchen Mechanismus zur Kontrolle von Cdc42 Aktivitätsmustern in Keratinozyten stützt. Letztendlich äußerte sich die Depletion von Cdc42 in einer Verminderung der Zellmigration sowie in einer signifikanten Reduktion der Kontraktion von peripheren Regionen. Dies bestätigt die Relevanz von Cdc42 für die Migration von Keratinozyten und deutet darauf, dass dabei die Kontrolle der Aktomyosin-Kontraktilität eine wichtige Rolle spielt.. Die Motilität von Keratinozyten wird unter anderem durch die Stimulierung von Wachstumsfaktoren, wie EGF, reguliert. Interessanterweise beeinflusste die EGF-Stimulation nicht die Cdc42 Aktivitätsmuster. Dies deutet darauf, dass die lokalen Aktivierungsmechanismen ein Teil der intrinsischen Zellmigrationsmaschinerie ist, welcher nicht durch Wachstumsfaktoren beeinflusst werden. Im Gegensatz hierzu wurden für die verwandte GTPase Rho signifikante Veränderungen der Aktivitätsmuster nach EGF-Stimulation beobachtet. Die Veränderungen der subzellulären Rho-Aktivitätssignale waren jedoch sehr transient. Beispielsweise wurden in der gesamten Zelle innerhalb der ersten 12 Minuten verstärkt Aktivitätspulse mit niedriger Amplitude beobachtet, welche jedoch nach einer Stunde wieder abnahmen. Ebenfalls wurde nach EGF-Zugabe ein deutlicher, wenn auch vorübergehender Anstieg der Rho-Aktivität in der Zellperipherie beobachtet, dem eine starke Kontraktion dieser Regionen folgte. Eine solche globale Zellkontraktion könnte erforderlich sein, um die Zellmigration effizienter zu induzieren, beispielsweise durch die Reorganisation der Topologie von Signalnetzwerken zur Steuerung der Rho-GTPase-Aktivität. Dieser vorübergehende Anstieg der Rho-Aktivität nach EGF-Zugabe kann daher auf ein empfindliches System hindeuten, welches durch Wachstumsfaktoren moduliert werden kann. Mit Hilfe eines fokussierten Überexpressions-Screens, welcher die Mitglieder der Lbc-Rho-GEFs umfasste, wurden im Folgenden tatsächlich mehrere GEFs identifiziert, welche in solch einem System die EGF-stimulierte transiente Erhöhung der Rho-Aktivität vermitteln können und daher potentiell an der Regulation von Rho in Keratinozyten beteiligt sind. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde die bereits in diesem Labor etablierte Zelllinie (U2OS) verwendet, um die früheren Studien zur der Regulation des Rho Aktivitätsnetzwerks weiter auszubauen und die Rolle der extrazellulären Matrix (ECM) besser zu verstehen. Hierbei konnte eine deutliche Verstärkung der Rho Aktivitätspulse durch die Verwendung der ECM-Substrate Fibronektin und Kollagen I gezeigt werden, was auf eine Verknüpfung von Integrin-abhängigen Signalwegen mit dem dynamischen Rho Aktivitätsnetzwerk hinweist. Des Weiteren konnten Lokalisationspulse der ERM Proteine Ezrin and Moesin am Zellkortex beobachtet werden, welche stark mit der Aktindynamik und den Rho Aktivitätspulsen korrelierten. Die Inhibierung des Rho-ROCK Signalweges führte zu einer deutlichen Reduktion der subzellulären Ezrin Pulse. Dieser Befund legt nahe, dass die ERM Protein-Dynamik in adherenten Zellen stromabwärts der Rho Aktivität und der Aktomyosin Pulse stattfindet. Zusammenfassend ergeben sich, basierend auf den Daten dieser Arbeit, neue Erkenntnisse zur Rolle der Rho-GTPase Cdc42 in der Migration von Keratinozyten, insbesondere im Hinblick auf Dynamik und Regulation der subzellulären Aktivitätsmuster der GTPase. Des Weiteren zeigen unsere Daten eine Korrelation der wachstumsfaktor-induzierten Rho Aktivitätspulse mit der dynamischen Änderung der Zellmorphologie beim Einsetzen der Zellmigration und präsentieren potenziell regulatorische GEF Proteine in diesem Zusammenhang. Bis dato sind wir weit davon entfernt, die zugrundliegenden Mechanismen zu verstehen, welche die lokalen Rho Aktivitätspulse regulieren und wie diese Aktivitätsmuster die Migration von Kerationzyten kontrollieren. Zukünftige Arbeiten, die auf den hier vorgestellten Erkenntnissen aufbauen, werden unser Verständnis diesbezüglich erheblich voranbringen und die therapeutischen Anwendungsbereiche bei krankhaft veränderten Prozessen im Zusammenhang mit Wundheilung und Reepithelisierung erweitern.