Sugar metabolism: from enzyme cascades towards physiology and application

Shen, Lu GND

S. solfataricus and S. acidocaldarius are among the best studied archaeal species up to date. Their central carbohydrate metabolism (CCM) has been clarified in some detail, however, leaving some open questions in respect to pathways of different carbon sources and their regulatory mechanisms. In this research, some of these open questions have been addressed, thus enhanced our understanding of the CCM in Archaea. In chapter 3.1, the putative pyruvate kinase and phosphoenolpyruvate synthetase (PEPS) from S. solfataricus catalyzing the carbon switch between PEP and pyruvate were recombinantly expressed, purified and characterized, indicating the corresponding annotated functions. In addition, it was indicated by effectors testing that the Sso-PK was allosterically inhibited by ATP and isocitrate, and the Sso-PEPS was inhibited by AMP and α-ketoglutarate, suggesting that in this carbon switch, glycolysis was inhibited under high energy charge (high concentration of ATP) and accumulation of building blocks in the TCA cycle (isocitrate), while gluconeogenesis was reduced under low cell energy charge (high concentration of AMP) and ammonium limitation. In chapter 3.2, pentose transport and pentose degradation pathways in S. acidocaldarius were intensively studied including transcriptomic analyses, enzyme activity assays in cell-free extract, protein expression, purification and characterization, as well as construction of gene deletion mutants and growth studies. The results revealed an ATP-binding cassette (ABC) transporter for pentose uptake and demonstrated that D-xylose as well as L-arabinose were mainly/exclusively degraded via the Weimberg pathway, while the Dahms pathway was dispensable in S. acidocaldarius MW001. In chapter 3.3, a pathway for L-fucose degradation in S. solfataricus was proposed based on the integrated systems biology approach. The activity of the responsible enzymes in cell-free extract of the L-fucose grown cells was demonstrated, and the involved proteins were recombinantly expressed, purified and characterized. Sulfolobus spp. are well known for their metabolic versatility utilizing a great variety of different carbon sources and they possess many unique characteristics in e.g. metabolism pathways, cellular structure and growth conditions. Hence Sulfolobus spp. offer great potential for industrial application as summarized in chapter 3.4. In chapter 3.5, the D-xylose degrading Weimberg pathway from the mesophilic bacterium Caulobacter crescentus was intensively studied. All of the involved proteins were recombinantly expressed, purified and characterized in detail. Based on the obtained dynamic parameters, a kinetic model was constructed which was able to precisely predict the cascade performance under different in vitro and in vivo conditions, thus allowing rational, computational pathway design exemplified by pathway optimization for highest conversion efficiency. In addition, the broad application potential of this enzyme cascade was demonstrated by the production of pure 2-keto-3-deoxy sugar acids and 4-hydroxyisoleucine.

Unten den bis heute entdeckte Archaea, S. solfataricus und S. acidocaldarius gehören zu den am besten untersuchten Spezies. Ihr zentraler Kohlenhydratstoffwechsel (ZKW) wurde detailliert aufgeklärt, wobei jedoch einige Fragen im Hinblick auf die (Abbau)Wege verschiedener Kohlenstoffquellen und deren Regulierungsmechanismen bisher nicht beantwortet sind. In dieser Arbeit wurden einige dieser offenen Fragen bearbeitet, wodurch das Verständnis der ZKW in Archaea verbessert wurde. In Kapitel 3.1 wurden die putative Pyruvat Kinase und die Phosphoenolpyruvat Synthetase (PEPS) aus S. solfataricus, die Umsetzung zwischen PEP und Pyruvat katalysieren und damit die Schaltstelle zwischen Glykolyse und Gluconeogenese bilden, rekombinant exprimiert, gereinigt und charakterisiert, was die entsprechenden annotierten Funktionen bestätigte. Darüber hinaus wurde durch Effektorstudien gezeigt, dass die Sso-PK durch ATP und Isocitrat und die Sso-PEPS durch AMP und α-Ketoglutarat allosterisch inhibiert wurden. Das deutet darauf hin, dass beim Umschalten zwischen kataboler und anaboler Richtung die Glykolyse durch eine hohe Energieladung der Zelle (hohe ATP-Konzentration) und Anhäufung von Bausteinen im TCA-Zyklus (Isocitrat) inhibiert wird. Dagegen wird die Gluconeogenese bei niedriger Energieladung (hohe AMP-Konzentration) und bei Ammoniumlimitierung verringert. In Kapitel 3.2 wurden Pentose-Transport und Pentose-Abbauwege in S. acidocaldarius intensiv untersucht. Dazu wurden Transkriptomanalysen, Enzymaktivitätsassays im zellfreien Extrakt, Proteinexpression, -reinigung und -charakterisierung sowie die Konstruktion von Gendeletionsmutanten und deren phenotypische Charakterisierung durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass ein ABC (ATP binding casette) -Transporter für die Pentoseaufnahme verantwortlich ist und dass D-Xylose sowie L-Arabinose hauptsächlich über den Weimberg-Weg abgebaut werden, während der Dahms-Weg in S. acidocaldarius MW001 auf den Pentose Abbau keinen Einfluss hat. In Kapitel 3.3 wurde basierend auf einem integrierten systembiologischen Ansatz ein Weg für den Abbau von L-Fucose in S. solfataricus vorgeschlagen. Die Aktivität der verantwortlichen Enzyme im zellfreien Extrakt der L-Fucose-Zellen wurde gezeigt, und die beteiligten Proteine wurden rekombinant exprimiert, gereinigt und charakterisiert. Sulfolobus spp. sind bekannt für ihre metabole Vielseitigkeit, die durch die Verwendung einer großen Vielfalt verschiedener Kohlenstoffquellen sowie durch weitere Eigenschaften einschließlich einzigartiger Stoffwechselwege, Zellstruktur und durch einzigartige Wachstumsbedingungen ihren Ausdruck findet. Daher bieten Sulfolobus spp. ein großes Potenzial für die industrielle Anwendung, was in Kapitel 3.4 zusammengefassend dargestellt wird. In Kapitel 3.5 wurde der Weimberg-Weg für den D-Xylose-Abbau in dem mesophilen Bakterium Caulobacter crescentus intensiv untersucht. Alle beteiligten Proteine wurden rekombinant exprimiert, gereinigt und detailliert charakterisiert. Basierend auf den enzymatischen Parametern wurde ein kinetisches Modell für den gesamten Stoffwechselweg ausgearbeitet, mit dem die Effizienzen der Enzymkaskade unter verschiedenen in vitro und in vivo Bedingungen präzise vorhergesagt werden konnten. Dadurch wird ein rationales, computergestütztes Pathway-Design ermöglicht, was durch die Optimierung des Weimberg-Weges im Hinblick auf die beste Umwandlungseffizienz gezeigt werden konnte. Das breite Anwendungspotenzial dieser Enzymkaskade wurde zudem durch die Produktion von reinen 2-Keto-3-deoxy-Zuckersäuren und 4-Hydroxyisoleucin nachgewiesen.

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Shen, L., 2020. Sugar metabolism: from enzyme cascades towards physiology and application. https://doi.org/10.17185/duepublico/70847
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