Analyse der Proteinqualitätskontrolle in der bakteriellen Zellhülle von E. coli

van Bürk, Yvonne GND

Die Vielzahl an Proteinen jeder Zelle stellt diese vor die Herausforderung, dass die Proteine im richtigen Kompartiment vorliegen und aktiv sind. Aus diesem Grund haben bakterielle Zellen effektive Mechanismen der Proteinqualitätskontrolle entwickelt, indem sie durch die Kontrolle des Proteinfaltungszustands die richtige Faltung, Reparatur oder Degradation der Proteine unterstützen. Reguliert wird dies durch spezielle Signalsysteme, welche die Genexpression verschiedener Chaperone, Faltungskatalysatoren und Proteasen an den momentanen Bedarf anpassen. Vor allem das Periplasma ist aufgrund der Zellarchitektur den Schwankungen der Umweltbedingungen in hohem Maße ausgesetzt, wodurch der Faltungszustand und die Funktionalität von periplasmatischen Proteinen, sowie die Integrität der Zellhülle beeinflusst wird. Auch in humanen Zellen können fehl- oder ungefaltene Proteine zu schwer- wiegenden Folgen für den gesamten Organismus führen. So wird zum Beispiel die Aggregation von Proteinen mit Krankheiten wie Alzheimer und Mukoviszidose in Verbindung gebracht. Um ein Verständnis der grundlegenden Mechanismen der Proteinfaltung zu erlangen, repräsentiert die Zellhülle des gramnegativen Bakteriums E. coli ein experimentelles Modelsystem. Die Faktoren der Proteinqualitätskontrolle scheinen in einem flexiblen Netzwerk organisiert zu sein, welches die Effizienz und Reaktionsfähigkeit erhöht und die Stabilität des Systems gewährleistet. Weski und Ehrmann sammelten erste Hinweise auf ein potentielles Netzwerk der Proteinqualitätskontrolle in der Zellhülle von E. coli. Die sieben Doppel-KO-Mutanten (degP dsbA, degP tsp, degP yfgC, degP ppiD, surA dsbA, surA ptrA und surA yfgC) zeigten in der Dissertation von Dr. Juliane Weski unter Stressbedingungen Probleme mit den Außenmembranproteinen FhuA, OmpW und LamB auf Proteinebene. In diesen Stämmen wurde entweder eine Reduktion der FhuA- oder OmpW-Menge in der Außenmembran detektiert, ohne dass eine reduzierte Genexpression vorlag, oder die Stämme wiesen Unregelmäßigkeiten im LamB-Vorkommen auf. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollten die zuvor gesammelten ersten Hinweise auf ein potentielles Netzwerk der Proteinqualitätskontrolle in der Zellhülle von E. coli weitergehend untersucht werden. Da über potentielle Interaktionen der Faltungshelfer untereinander und zu den entsprechenden Substraten bisher wenig bekannt ist, wurde zunächst in den oben genannten Deletionsstämmen jeweils ein Knockout durch eine extrachromosomale Überexpression ausgeglichen. Die dabei hergestellten Proteine wurden im Anschluss gereinigt und in Bezug auf die gebundenen Substrate massenspektrometrisch analysiert. Um eine Proteolyse der Substrate zu verhindern, wurden bei den Proteasen enzymatisch inaktive Mutanten genutzt. Es konnten für jeden in dieser Arbeit untersuchten Faltungshelfer mittels massen- spektrometrischer Analysen gebundene potentielle Substrate detektiert werden. Die Anzahl der Substrate variierte dabei stark. Durch die Anzahl an Substraten scheinen die Proteine DegP, DegQ, DsbA/DsbAPT, SurA und Prc Schlüsselspieler in dem System der Proteinqualitätskontrolle zu sein, während BepA, PtrA und PpiD Enzyme mit enger Substratspezifität zu sein scheinen. Besonders interessant sind die im Rahmen dieser Arbeit erhaltenen Ergebnisse, dass Faltungshelfer durchaus gemeinsame Substrate haben. So wurden zum Beispiel bei zwei oder sogar mehreren Faltungshelfern die gleichen Substrate gefunden. Diese Schnittmengen bestätigen die Hypothese, dass die periplasmatische Proteinqualitätskontrolle als flexibles Netzwerk organisiert ist. Ein weiterer Punkt, der diese These stützt, ist die Tatsache, dass neben potentiellen Substraten auch andere Faltungshelfer an die jeweils untersuchten Faltungshelfer gebunden haben. Um die Hypothese zu untersuchen, dass mehrere Faltungsfaktoren gleichzeitig mit einem Substrat interagieren, wurden Degradationsassays mit den Proteasen DegP, DegQ und Prc und dem denaturierten Substrat EfeB etabliert und durchgeführt. Durch die Zugabe der Faltungshelfer DsbAPT, PpiD und SurA wurden Unterschiede im Schnittmuster und der Anzahl der Schnitte festgestellt, was auf eine Protektion des denaturierten Substrats durch die Faltungshelfer hindeutet. Diese Ergebnisse, dass ein Faltungshelfer das denaturierte Substrat protektiert, während ein zweites Enzym zeitgleich zugängliche Bereiche degradiert, bestätigen die in dieser Arbeit aufgestellte These, dass mehrere Enzyme bzw. Faltungshelfer gleichzeitig an einem Substrat binden. Die Möglichkeiten der Komplexbildung von Faltungshelfern/Enzymen und Substraten stellen dabei eine interessante Fragestellung für weiterführende Studien dar.

The large number of proteins in each cell poses the challenge of ensuring that the proteins are present and active in the right compartment. For this reason, bacterial cells have developed effective mechanisms of protein quality control by supporting the proper folding, repair or degradation of proteins by controlling the state of protein folding. This is regulated by special signalling systems that adapt the gene expression of various chaperones, folding catalysts and proteases to the momentary need. The periplasm in particular is highly exposed to environmental variations due to the cell architecture, which influences the folding state and functionality of periplasmatic proteins, as well as the integrity of the cell envelope. Even in human cells, misfolded or unfolded proteins can lead to severe consequences for the entire organism. For example, the aggregation of proteins is associated with diseases such as Alzheimer's and cystic fibrosis. In order to gain an understanding of the basic mechanisms of protein folding, the cell envelope of the gram-negative bacterium E. coli represents an experimental model system. The factors of protein quality control appear to be organized in a flexible network that increases efficiency and responsiveness and ensures the stability of the system. Weski and Ehrmann collected first evidence of a potential network of protein quality control in the cell envelope of E. coli. The seven double-KO mutants (degP dsbA, degP tsp, degP yfgC, degP ppiD, surA dsbA, surA ptrA and surA yfgC) showed problems with the outer membrane proteins FhuA, OmpW and LamB at the protein level under stress conditions in Dr. Juliane Weski's dissertation. In these strains, either a reduction of the FhuA or OmpW amount in the outer membrane was detected without a reduced gene expression, or the strains showed irregularities in the LamB occurrence. Within the scope of the present work, the previously collected first indications of a potential network of protein quality control in the cell envelope of E. coli were to be investigated in further detail. Since little is known about potential interactions of the folding factors with each other and with the corresponding substrates, a knockout in each of the above-mentioned deletion strains was initially compensated by extrachromosomal overexpression. The proteins produced in the process were then purified and analysed by mass spectrometry with respect to the bound substrates. In order to prevent proteolysis of the substrates, enzymatically inactive mutants of the proteases were used. For each folding factor investigated in this work, potential bound substrates could be detected using mass spectrometric analyses. The number of substrates varied greatly. Due to the number of substrates, the proteins DegP, DegQ, DsbA/DsbAPT, SurA and Prc seem to play key roles in the system of protein quality control, while BepA, PtrA and PpiD appear to be enzymes with narrow substrate specificity. Of particular interest are the results obtained from this work, which show that folding factors have common substrates. For example, the same substrates were found in the analysis of interaction partners of two or more folding factors. These intersections confirm the hypothesis that periplasmic protein quality control is organised as a flexible network. Another point that supports this hypothesis is the fact that, in addition to potential substrates, other folding factors have also linked to the respective folding factors investigated. In order to investigate the hypothesis that several folding factors interact simultaneously with a substrate, degradation assays with the proteases DegP, DegQ and Prc and the denatured substrate EfeB were established and performed. The addition of the folding factors DsbAPT, PpiD and SurA revealed differences in the pattern and number of cuts, suggesting protection of the denatured substrate by the folding factors. These results, that a folding factor protects the denatured substrate while a second enzyme degrades simultaneously accessible areas, confirm the hypothesis that several enzymes or folding factors bind simultaneously to one substrate. The possibilities of complex formation of folding factors/enzymes and substrates represent an interesting question for further studies.

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van Bürk, Y., 2019. Analyse der Proteinqualitätskontrolle in der bakteriellen Zellhülle von E. coli. https://doi.org/10.17185/duepublico/70816
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