Toll-like receptors contribute to non-canonical inflammasome-driven IL-1 release

Toll–like receptors (TLRs) and inflammasomes confer microbial infection and trauma immunity by virtually instantly sensing pathogen as well as host-derived danger-associated molecular patterns (P/DAMPs) such as bacterial LPS and ATP, respectively. Inflammasomes mediate maturation and release of specific and e.g. TLR induced IL-1 cytokine family members through cleavage by integral caspase-1. While standard inflammasomes encompass caspase-1 and NACHT, LRR and PYD domains-containing NOD-like receptors (NLRs) often besides apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain (ASC), the non-canonical inflammasome carries NLRP3 specifically and murine caspase-11 or human
caspase-4 and/or -5 additionally. Both, caspase-11/4/5 dependence and TLR4 independence of transfected LPS driven IL-1β release in vitro and of non-transfected LPS driven pathology in vivo (Kayagaki, Warming et al. 2011; Hagar, Powell et al. 2013; Kayagaki, Wong et al. 2013), as well as LPS binding to cellular caspase-11/4/5 (Shi, Zhao et al. 2014) raised the “noncanonical” inflammasome concept. We here sensitized mice lacking expression of a central TLR and IL-1 receptor signal mediator molecule not employed merely by TLR3, namely Myd88-/- mice, as well as Tlr2/4-/- mice by high-molecular weight polyI:C administration six hours upon which high dose LPS was applied largely according with an established protocol.
In contrast to challenged Tlr4-/- mice, Myd88-/- and Tlr2/4-/- like Caspase11-/- counterparts failed to succumb to a fatal shock syndrome. Moreover, we observed a capacity of smooth LPS to not merely translocate upon transfection such as with Fugene and Cholera Toxin B, but to also enhance transfection borne translocation of other TLR ligands such as RNA40 (TLR7/8 agonist), ODN1668 (TLR9 agonist), and Sa19 (TLR13 agonist) endosomally. Accordingly, if applied as priming stimuli (1. hit) numerous TLR ligands contributed to transfected LPS (2. hit) driven IL-1β release induction and upon distinct transfection reagent usage were suitable 2. hit agents. Notably, rough LPS induced primed-cell non-canonical inflammasome activity independently of transfection reagent application. Our results indicate a lack of a capacity of
primed Tlr2/4-/- macrophages to harbor LPS translocation driven non-canonical inflammasome activation, as if besides TLR4 also TLR2 recognizes endosomal LPS, and that signaling from activated endosomal TLRs towards caspase-11/4/5 through MyD88 rather than LPS-caspase-11 binding is the prerequisite of in this formerly unappreciated respect non-canonical
inflammasome activation.

Toll-like-Rezeptoren (TLRs) und Inflammasomen vermitteln Immunität gegen mikrobielle Infektionen und Traumata, indem sie Pathogene sowie von ihnen und vom Wirt produzierte molekulare Muster (P/DAMPs), wie z.B. bakterielles LPS und ATP, respektive, praktisch instant erkennen. Inflammasomen vermitteln die Reifung und Freisetzung spezifischer und z.B. über TLR induzierter Mitglieder der IL-1-Zytokinfamilie durch Spaltung durch die integrale
Caspase-1. Während Standardinflammasomen Caspase-1 und NACHTLRRPYD Domänen enthaltende NOD-ähnliche Rezeptoren (NLR), oft neben dem Apoptose assoziierten Fleck-ähnlichen Protein mit Caspase Rekrutierungsdomäne (ASC), umfassen, tragen nichtkanonische Inflammasomen spezifisch den NLR NLRP3 und murine Caspase-11 oder humane Caspase-4 und/oder -5 zusätzlich. Sowohl die Caspase-11/4/5-Abhängigkeit, als auch die TLR4-Unabhängigkeit der Freisetzung von transfiziertem LPS-getriebener IL-1β Freisetzung in vitro und der von nicht-transfiziertem LPS-getriebenen Pathologie in vivo (Kayagaki, Warming et al. 2011; Hagar, Powell et al. 2013; Kayagaki, Wong et al. 2013), sowie die Bindung von LPS an zelluläre Caspase-11/4/5 (Shi, Zhao et al. 2014), brachte das "nichtkanonische" Inflammasom-Konzept auf. Wir haben Mäuse  sensibilisiert, denen die Expression eines zentralen TLR- und IL-1-Rezeptorsignal-Mediatormoleküls fehlt, nämlich Myd88-/- Mäuse, sowie Tlr2/4-/- Mäuse, durch Verabreichung von langkettigem polyI:C sechs
Stunden vor Gabe von Hochdosis-LPS weitgehend gemäß einem etablierten Protokoll. Im Gegensatz zu Tlr4-/- Mäusen fielen Myd88-/- und Tlr2/4-/- ebenso wie Caspase11-/- Mäuse nicht einem fatalen Schocksyndrom anheim. Darüber hinaus translozierte „weiches“ LPS nicht nur bei Transfektion mit z.B. Fugen- und Choleratoxin B, sondern verstärkte auch die durch Transfektion hervorgerufene endosomale Translokation anderer TLR-Liganden RNA40
(TLR7/8-Agonist), ODN1668 (TLR9) und Sa19 (TLR13). Dementsprechend trugen, wenn sie als Priming-Stimulus (1. Hit) angewendet wurden, zahlreiche TLR-Liganden zur Induktion der durch transfiziertes LPS (2. Hit) getriebenen IL-1β-Freisetzung bei und waren abhängig von den verwendeten Transfektionsreagenzien wirksame 2. Hit Reagenzien.
Bemerkenswerterweise induzierte „raues“ LPS eine nicht-kanonische Inflammasom-Aktivität der vorstimulierten Zellen unabhängig von einer Verwendung eines Transfektionsreagenzes. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass vorstimulierte Tlr2/4-/- Makrophagen nicht die Fähigkeit besitzen die durch LPS-Translokation bedingte nicht-kanonische Entzündungsaktivierung zu vermitteln, als ob neben TLR4 auch TLR2 endosomales LPS erkennt. Zudem ist eine Signalübertragung von aktivierten endosomalen TLRs in Richtung Caspase-11/4/5 per MyD88, eher als die Bindung von LPS an Caspase-11, die Voraussetzung für eine nicht-kanonische Aktivierung von Inflammasomen

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