Novel strategies for targeted lipidomics in complex biological systems
Lipids are fundamental biomolecules deeply involved in numerous biological processes. To elucidate the roles of lipids in biological systems, the study of lipidomics emerged with support from state-of-the-art analytical techniques. However, the high complexity of lipids resulted in many analytical challenges to obtain analyses of whole lipidomes. Therefore, a strategy called targeted lipidomics focuses on scanning and quantifying of selected groups of lipids only. However, one of the main challenges of targeted lipidomics is the lack of suitable bioinformatics tools and workflows to set up a targeted assay for the huge variety of lipid classes. Thus, the aim of this thesis is to improve the targeted lipidomics workflows, including the creation of targeted assays and the parameters for chromatographic separation, and apply and validate developed workflows to different model systems such as the RAW 264.7 cell line (a community model) or platelets as an ex-vivo model. Firstly, an interim strategy was developed to adapt Skyline (a targeted proteomics software package) for targeted lipidomics analyses. Secondly, LipidCreator was developed, the first open source software fully supporting the targeted lipidomics assay development. LipidCreator not only delivers the computation of fragment masses of over 60 lipid classes, it also provides the functionality to define fragments, introduces stable isotope labeling of lipids for targeted assays, provides an optimization module for collision energy and generates in-silico spectral libraries. This software can either be used as a standalone tool or with Skyline. On the basis of LipidCreator, the high performance chromatography/mass spectrometry-based targeted lipidomics workflows including extraction optimization, lipid category tailored gradients and fragmentation rules in mass spectrometry were established, leading to significantly increased accuracy for the analysis of targeted lipids. Finally, the established targeted approaches were utilized in conjunction with shotgun lipidomics, enabling us to create a first quantitative draft of the platelet lipidome covering almost 400 lipids species derived from 28 lipid classes and a dynamic abundance range of seven orders of magnitude. The result of the resting platelet lipidome indicated that only 15 lipids comprise 70% of the whole lipid content of platelets. In addition to this, a systematic assessment of the lipidomics network revealed that 80% of the platelet lipidome is unaffected by the change from resting to the activated state, indicating the feasibility of quantitative and differential comprehensive lipidome analyses. The strategies were further applied to a rare disease model (Niemann-Pick A/B) which displays clotting and bleeding issues. For this disease model, it was investigated whether lipids are responsible for this phenotype. The results showed a strong upregulation of sphingosylphosphorylcholine (SPC) and a direct pathophysiological effect of SPC on the platelet activation and thrombus formation. In conclusion, the established platform has been successfully applied to the quantitative study of biological systems.
Lipide sind grundlegende Biomoleküle, die an vielen biologischen Prozessen beteiligt sind. Um ihre Funktionen in biologischen Systemen aufzuklären, stützt sich die lipidomics auf modernste analytische Techniken. Die hohe Komplexität der Lipide führt jedoch bei einer lipidome-weiten Analyse zu vielen analytischen Herausforderungen. Daher konzentriert sich die targeted lipidomics auf die Identifikation und Quantifizierung einzelner Lipidgruppen. Eine der größten Herausforderungen dieser Strategie ist das Fehlen geeigneter Bioinformatik-Werkzeuge und Arbeitsabläufe, um targeted assays für die Vielzahl der Lipidklassen zu erstellen. Daher bestand das Ziel dieser Arbeit darin, die Arbeitsabläufe sowie das Erstellen von targeted-Lipidanalysen inklusive der Parameter für eine ausreichende, chromatographische Trennung zu verbessern. Im Anschluss sollte dies durch die Anwendung an verschiedenen Modellsystemen wie der RAW 264.7-Zelllinie als community-Modell oder Blutplättchen als ex-vivo-Modell validiert werden.
Zunächst wurde eine Interimsstrategie entwickelt, um Skyline (eine Software für targeted proteomics) für die targeted lipidomics-Analyse anzupassen. Anschließend wurde die erste open-source-Software namens LipidCreator entwickelt, welche das Erstellen von lipidomics assays vollständig unterstützt. LipidCreator stellt nicht nur die Berechnung von Fragmentmassen von über 60 Lipidklassen bereit, sondern erlaubt dem Benutzer eigene Fragmente zu definieren, unterstützt eine stabile Isotopenmarkierung, bietet ein Optimierungsmodul für Kollisionsenergien und erzeugt darüber hinaus in-silico-Spektralbibliotheken. Diese Software kann als standalone-Tool oder in Verbindung mit Skyline verwendet werden. Auf Grundlage der Hochleistungs-Chromatographie / Massenspektrometrie-basierenden Arbeitsabläufe für die targeted lipidomics einschließlich der Extraktionsoptimierung, wurden maßgeschneiderte Gradienten für die einzelnen Lipidkategorien sowie Fragmentierungsregeln für die Massenspektrometrie entwickelt. Dies erhöhte die Genauigkeit der Analyse von Lipiden erheblich.
Schließlich wurden die etablierten zielgerichteten Ansätze in Verbindung mit dem sogenannten shotgun lipidomics-Verfahren verwendet, um eine erste quantitative Beschreibung des Plättchenlipidoms zu erstellen. Durch diese Kombination wurden insgesamt 400 Lipide aus 28 Lipidklassen und ein dynamischer Abundanzbereich von sieben Größenordnungen abgedeckt. Das Ergebnis des inaktiven Blutplättchen-lipidomes zeigte, dass nur 15 Lipide circa 70% der Masse des Gesamt-lipidomes ausmachen. Zusätzlich ergab die systematische Auswertung des Lipid-Netzwerks, dass 80% des Blutplättchen-lipidomes beim Übergang vom inaktiven in den aktiven Zustand unverändert bleibt. Die Strategien wurden außerdem auf ein seltenes Krankheitsmodell (Niemann-Pick A/B) angewendet, bei dem Gerinnungs- und Blutungsprobleme auftreten. Für dieses Krankheitsmodell wurde der Einfluss von Lipiden auf deren Funktion untersucht. Die Ergebnisse zeigten eine starke Hochregulierung von Sphingosylphosphorylcholin (SPC) und einen direkten pathophysiologischen Effekt von SPC auf die Blutplättchenaktivierung und Thrombus-Bildung. Zusammenfassend wurde die aufgebaute Plattform erfolgreich an einer quantitativen Studie aus dem Bereich der biologischen Systeme durchgeführt.
Zunächst wurde eine Interimsstrategie entwickelt, um Skyline (eine Software für targeted proteomics) für die targeted lipidomics-Analyse anzupassen. Anschließend wurde die erste open-source-Software namens LipidCreator entwickelt, welche das Erstellen von lipidomics assays vollständig unterstützt. LipidCreator stellt nicht nur die Berechnung von Fragmentmassen von über 60 Lipidklassen bereit, sondern erlaubt dem Benutzer eigene Fragmente zu definieren, unterstützt eine stabile Isotopenmarkierung, bietet ein Optimierungsmodul für Kollisionsenergien und erzeugt darüber hinaus in-silico-Spektralbibliotheken. Diese Software kann als standalone-Tool oder in Verbindung mit Skyline verwendet werden. Auf Grundlage der Hochleistungs-Chromatographie / Massenspektrometrie-basierenden Arbeitsabläufe für die targeted lipidomics einschließlich der Extraktionsoptimierung, wurden maßgeschneiderte Gradienten für die einzelnen Lipidkategorien sowie Fragmentierungsregeln für die Massenspektrometrie entwickelt. Dies erhöhte die Genauigkeit der Analyse von Lipiden erheblich.
Schließlich wurden die etablierten zielgerichteten Ansätze in Verbindung mit dem sogenannten shotgun lipidomics-Verfahren verwendet, um eine erste quantitative Beschreibung des Plättchenlipidoms zu erstellen. Durch diese Kombination wurden insgesamt 400 Lipide aus 28 Lipidklassen und ein dynamischer Abundanzbereich von sieben Größenordnungen abgedeckt. Das Ergebnis des inaktiven Blutplättchen-lipidomes zeigte, dass nur 15 Lipide circa 70% der Masse des Gesamt-lipidomes ausmachen. Zusätzlich ergab die systematische Auswertung des Lipid-Netzwerks, dass 80% des Blutplättchen-lipidomes beim Übergang vom inaktiven in den aktiven Zustand unverändert bleibt. Die Strategien wurden außerdem auf ein seltenes Krankheitsmodell (Niemann-Pick A/B) angewendet, bei dem Gerinnungs- und Blutungsprobleme auftreten. Für dieses Krankheitsmodell wurde der Einfluss von Lipiden auf deren Funktion untersucht. Die Ergebnisse zeigten eine starke Hochregulierung von Sphingosylphosphorylcholin (SPC) und einen direkten pathophysiologischen Effekt von SPC auf die Blutplättchenaktivierung und Thrombus-Bildung. Zusammenfassend wurde die aufgebaute Plattform erfolgreich an einer quantitativen Studie aus dem Bereich der biologischen Systeme durchgeführt.