In-vivo characterization of therapeutic antibodies after subcutaneous injection using a LC-MS based immuno-capture assay

Doell, Annika GND

Therapeutic antibodies have become increasingly important in the treatment of autoimmune diseases and different types of cancer. During production and storage the protein molecules can undergo modification due to different degradation reactions, which may decrease biological activity and/or bioavailability of the antibody. Therefore, the analysis of protein modifications on the peptide level using liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC-MS) is a common approach to characterize protein therapeutics. While analysis of in-vitro samples is performed routinely, the full characterization of protein therapeutics after in-vivo administration is highly challenging due to the low protein amount that is available for analysis. The work described in this thesis focuses on the development of a complete workflow that enables full characterization of therapeutic antibodies after subcutaneous injection. At first, a suitable capture protocol to purify the therapeutic antibody from complex biological matrices was developed in order to remove matrix proteins that may interfere with the mass spectrometric analysis. Best results were achieved using a commercial anti-human capture antibody fragment in combination with streptavidin coated magnetic beads providing capture efficiencies of 90-100%. The obtained results further demonstrated that the protocol works in an unbiased way and allows capturing both, stressed and unstressed material. To localize then the sites of particular modifications, it is a common approach to apply enzymatic digestion followed by LC-MS analysis (peptide map). This peptide map procedure is routinely performed using 250 µg antibody for digestion. However, for in-vivo samples only a few hundred nanogram (up to 1 µg) are available for analysis. Therefore, a part of this thesis is also focused on the development of a special digestion protocol suitable for low sample amounts. The final workflow requires less than 1 µg antibody, includes two desalting steps and shows sequence coverages of 95-100%. Thus, compared to standard in-vitro approaches a 250-fold reduction of the required amount of antibody was achieved. With the implementation of a nano-LC-MS platform the required sensitivity for the analysis of in-vivo samples was realized. Thus, compared to a standard flow LC using 2.1 mm columns, the developed nano-LC platform offers a 300-fold sensitivity increase. Finally, the workflow was successfully applied for the characterization of a therapeutic antibody after subcutaneous injection in both, serum and interstitial fluid. This is the first time that a therapeutic antibody has been extracted from the subcutis of a pig after subcutaneous injection and got fully characterized. Overall, the results revealed the same modifications for both sample types and therefore it can be concluded that the antibody is not modified in the subcutaneous tissue after injection within the first ten hours. The ability to specifically capture and fully characterize therapeutic antibodies from biologic matrices is a major improvement and of high importance for the development of biotherapeutics. This workflow described here lays the foundation for future experiments to answer the question of what happens to antibodies after injection in-vivo. Thus, a better understanding of the in-vivo processes could contribute to an improved risk assessment of biopharmaceuticals during development, manufacturing and storage.

Die Bedeutung therapeutischer Antikörper in der Krebstherapie sowie zur Behandlung von schweren Autoimmunkrankheiten nimmt stetig zu. Bei der Produktion und Lagerung der Moleküle, kann es jedoch zu verschiedensten Degradationsreaktionen kommen. Diese wiederum können zu einer verminderten biologischen Aktivität, sowie einer reduzierten Bioverfügbarkeit der Antikörper im Patienten führen. Daher ist die Analyse der Moleküle von großer Bedeutung und wird standardmäßig auf Peptidebene mittels Flüssigchromatographie gekoppelter Massenspektrometrie (LC-MS) betrieben. Während die Charakterisierung der Antikörper in-vitro Routine ist, stellt ihre Analyse nach Verabreichung in-vivo eine große Herausforderung dar. Dies ist vor allem darin begründet, dass der Antikörper nach der Injektion in einer komplexen biologischen Matrix vorliegt und zusätzlich nur in sehr geringen Mengen zur Verfügung steht. Das Ziel dieser Arbeit lag somit in der Entwicklung einer geeigneten Methode zur vollständigen Charakterisierung von therapeutischen Antikörpern nach der subkutanen Injektion. Um den Antikörper nach der Injektion aus der biologischen Matrix zu isolieren, wurde zunächst ein Protokoll zur spezifischen Aufreinigung entwickelt. Die besten Ergebnisse wurden mit einem kommerziellen anti-humanen Capture-Fragment in Kombination mit Streptavidin-beschichteten Magnetic Beads erzielt. Mit Hilfe dieses Protokolls konnten Aufreinigungseffizienzen von 90-100% erreicht werden. Ebenso wurde demonstriert, dass auch modifizierte Antikörper aufgereinigt werden und die Ergebnisse somit unverfälscht sind. Um die genaue Position einer Modifikation im Antikörper zu bestimmen, ist es hilfreich diesen in kleinere Stücke zu schneiden. Ein klassischer Ansatz ist hier der enzymatische Verdau in Peptide (Peptide Map). Während bei in-vitro Analysen mehrere hundert Mikrogramm Antikörper eingesetzt werden können, stehen bei in-vivo Proben meist nur ein paar hundert Nanogramm bis hin zu einem Mikrogramm zur Verfügung. Der Fokus lag somit auch auf der Entwicklung eines Peptide Map-Protokolls für in-vivo Proben. Der finale Ansatz beinhaltet zwei Entsalzungsschritte und benötigt eine absolute Menge an Antikörper von weniger als einem Mikrogram bei einer Sequenzabdeckung von 95-100%. Somit wurde im Vergleich zu in-vitro Analysen eine 250-fache Reduzierung der benötigten Menge an Antikörper erreicht. Mit der erfolgreichen Implementierung einer Nano-HPLC-MS Plattform konnte zudem ein 300-facher Sensitivitätsgewinn im Vergleich zu Standard-Fluss Geräten erreicht werden. Das gesamte Protokoll wurde erfolgreich für die Charakterisierung eines therapeutischen Antikörpers nach subkutaner Injektion angewendet und liefert erstmals Erkenntnisse über subkutan auftretenden Modifikationen. Mithilfe dieser Studie kann geschlussfolgert werden, dass der Antikörper innerhalb der ersten zehn Stunden nach der Injektion in der Subkutis nicht modifiziert wird. Die Fähigkeit therapeutische Antikörper spezifisch aus biologischen Matrices aufzureinigen und vollständig zu charakterisieren ist ein großer Benefit für die Entwicklung von Biotherapeutika. Der in dieser Arbeit entwickelte Ablauf legt den Grundstein zur Beantwortung der Frage was mit Antikörpern nach der Injektion passiert. Ein genaueres Verständnis der in-vivo Prozesse kann zu einem besseren Produkt-Risiko Verständnis in der Entwicklung, Herstellung und Lagerung führen.

Preview

Share and cite

Citation style:

Doell, Annika: In-vivo characterization of therapeutic antibodies after subcutaneous injection using a LC-MS based immuno-capture assay. 2019.

Could not load citation form. Default citation form is displayed.

Rights

Use and reproduction:
All rights reserved

Export