Development of a thermospray nebulizer interface for liquid chromatography with flame ionization detection and detector response studies of volatile and non-volatile compounds

Becker, Christian GND

Liquid chromatography (LC) is the analytical tool of choice for the investigation of by-products in pharmaceutical and chemical industry. The UV- and refractive index detector (RFID) encounter to the most common detectors for these purposes. The detection of unknown by-products deliver no sufficient information, since both detectors only can be used for a limited spectrum of analytes. Furthermore, without knowledge of the chemical structure, a semi-quantitative analysis is barely possible. The flame ionization detector (FID) is advantageous to provide semi-quantitative data in the detection and quantification of, e.g., synthesis by-products in pharmaceuticals and chemical products. In contrast to commonly applied detectors, the FID signal is proportional to the carbon content of the analyte and allows the estimation of an analyte concentration directly out of the obtained signal. Several attempts to employ the FID for liquid chromatography have been carried out until yet [1]. This thesis described the development of a novel LC/FID interface and a FID response study of more than 100 compounds in order to achieve a better understanding of differences between gas chromatography (GC)/FID and LC/FID response data. The thesis was divided into 3 major sections: 1. a detailed study of previously described interfaces, 2. the development and optimization of a novel interface and 3. the analysis and comparison of response data obtained by GC/FID and LC/FID. The historical conveyor type systems were designed to overcome the problems arise in FI detection by use of organic solvents in liquid chromatography. Therefore the systems dependent choice of non-volatile analytes in the beginning of LC/FID coupling change to volatile analytes by implementation of only water liquid chromatography [1]. Previously invented interfaces were studied to find out the advantages and disadvantages between the different types of interfaces, such as conveyor based interfaces, capillary jet interfaces or spray chamber interfaces. The focus was set on direct coupling techniques which can be operated without pre-evaporation steps of signal disturbing organic solvents, as known from conveyor type interfaces. The advantages and disadvantages of these interfaces were critically reviewed to design and present a novel interface. In the development and optimization of the here designed interface the influence of the nebulizer material on flame stability and capillary blockage was shown. Previously reported problems such as blocking of the transfer capillary were solved using a stainless steel nebulizer body and transfer capillary. The effects of the working parameters such as backpressure, gas flow, distance between nebulizer nozzle and FID collector or FID temperature on the signal were analyzed. The novel interface was validated for selected compounds known from literature. The linear correlation of the concentration and obtained FID signal of 21 N-heterocycles and 6 alcohols was found to be R² = 0.991 to 0.999. The limits of detection of N-heterocycles ranged from 0.24 ng (pyrimidine-N-oxide) to 1.26 ng (s-triazin) absolute injected carbon. Obtained results for chromatographic separation of the alcohols propanol, butanol, pentanol and hexanol, used within previous studies in the field of LC/FID coupling were presented and compared to literature. The developed interface showed a substantial improvement of the absolute injected carbon concentration down to 0.28 ng (ethanol) in comparison to previously invented interfaces. The use of different theoretical and practical response models was discussed to assist the response studies performed in the final section of the thesis. The scope was set on the experimental derived Effective Carbon Number (ECNExp) [2, 3] and experimental relative sensitivity (RFExp) [2, 4], respectively. The influences of functional groups and substitutes, such as hydroxyl groups, halogens and ketones were discussed regarding former GC/FID studies. For some functional groups, effects on the obtained signals were found to be more negligible by extension of the carbon backbone. The influence of mono-alcohols decreased from C1 to C7. The effects of mono-, di- and poly-substituted compounds were compared and a substantial effect of the substitute location and the response factor was observed for, e.g., butan-1,2-ole. Inflame processes for pyrimidine and pyridazine were proposed by the support of literature data. The response data of structural isomers obtained by theoretical response models (e.g. pyridine) were compared to experimental data of literature and within this study. The differences of theoretical isomer response data (e.g. pyridine, pyrimidine) to experimental data were explained by the occurring inflame processes. In the end the response data were compared to GC/FID response data as far as they are available. The present work is a great step forward for the analysis of volatile and non-volatile compounds using LC/FID. For the first time the responses of more the 100 different compounds were detected using LC/FID and compared to GC/FID response data if available. Much more LC feasible compounds are available, therefore further work is necessary to investigate all of this compounds and compare them to GC/FID responses. Further research in pharmaceutical industry is required to show the advantages of the semi-quantitative analysis of by-products by LC/FID. References [1] C. Becker, M.A. Jochmann, T.C. Schmidt, An Overview of Approaches in Liquid Chromatography Flame ionization Detection, TrAC Trends in Analytical Chemistry, 110 (2018) 143-149. [2] J.T. Scanlon, D.E. Willis, Calculation of Flame Ionization Detector Relative Response Factors Using the Effective Carbon Number Concept, J. Chromatogr. Sci., 23 (1985) 333-340. [3] J.C. Sternberg, Gallaway, W.S. and Jones, D.T.L., The Mechanism of Response of Flame Ionization Detectors, in: Gas Chromatography: Third International Symposium Held Under the Auspices of the Analysis Instrumentation Division of the Instrument Society of America, June 13-16, 1961, Academic, 1962, pp. 231-267. [4] W.A. Dietz, Response Factors for Gas Chromatographic Analyses, J. Chromatogr. Sci., 5 (1967) 68-71.

Die Flüssigchromatographie (LC) ist die Methode der Wahl für die Untersuchung von pharmazeutischen bzw. chemischen Produkten und derer Synthese-Nebenprodukte. Der UV-Detektor und Brechungsindexdetektor (RFID) zählen zu den am häufigsten verwendeten Detektoren für diese Untersuchungen. Beide Detektoren liefern jedoch nur unzureichende Informationen über die zu untersuchenden Nebenprodukte, da sie nur für ein kleines Spektrum an Verbindungen angewandt werden können und bei nicht Kenntnis der Struktur nur eine limitierte Aussagekraft in der quantitativen Analyse von Nebenprodukten vorweisen. Der Flammenionisationsdetektor (FID) bietet deutliche Vorteile in der semi-quantitativen und qualitativen Analyse von u.a. Synthese-Nebenprodukten in der pharmazeutischen und chemischen Industrie. Im Gegensatz zu den häufig verwendeten UV- und RFI-Detektoren besitzt der FID ein konzentrationsabhängiges Detektorsignal, welches proportional zu dem Kohlenstoffgehalt der Verbindung ist. Die Proportionalität zwischen Signal und Kohlenstoffgehalt ermöglicht eine semi-quantitative Konzentrationsbestimmung auch unbekannter Nebenprodukte. Es wurden bereits zahlreiche Versuche unternommen, diesen in der Gaschromatographie verwendeten Vorteil des FID auch für die LC nutzbar zu machen [1]. Diese Arbeit beschreibt die Entwicklung eines neuen LC/FID Interface und die damit durchgeführten Responsestudien an über 100 verschiedenen Substanzen, um ein besseres Verständnis der Unterschiede zwischen GC/FID und LC/FID Responsen zu erhalten. Die Arbeit unterteilt sich in drei Segmente: 1. eine detaillierte Studie von bereits in der Literatur erwähnten LC/FID Systemen, 2. die Entwicklung und Optimierung eines neuen LC/FID Interfaces und 3. die Analyse von verschiedenen leichtflüchtigen bis schwerflüchtigen Substanzen und der Vergleich der experimentellen Responsen zwischen GC/FID und LC/FID. In der Vergangenheit wurden LC/FID Interfaces so entwickelt, dass sie die in der LC verwendeten organischen Lösungsmittel durch Förderbänder und Verdampfer-Einheiten beseitigen konnten. Daher waren die ersten LC/FID Systeme auf die Analyse von schwerflüchtigen Substanzen limitiert, welche nicht im Lösungsmittelverdampfungsschritt entfernt wurden. Das Design änderte sich jedoch mit der Einführung von rein wässrigen LC Methoden. Die Einführung dieser Methode ermöglichte die direkte Kopplung von LC und FID durch z.B. Kapillar-Jet-Interfaces oder die Zerstäuber-Sprüh-Kammer. Eines der am häufigsten berichteten Probleme von Kapillarbasierten Interfaces ist das Verstopfen der Transferkapillare für den Eintrag der wässrigen mobilen Phase in den FID. Für die Untersuchung dieses Problems wurden verschiedene Materialien und Systemaufbauten getestet. Die Untersuchungen zeigten, dass der Effekt durch ein rein stahlbasiertes System mit Transferkapillaren, welche einen größeren Innendurchmesser als die bis dahin verwendeten Glaskapillaren haben, nahezu vollständig beseitigt werden kann. Da die Verwendung solcher Kapillaren jedoch eine Restriktion innerhalb des Systems erfordert, wurde der Einfluss von verschiedenen Rückdrucken untersucht. Weitere Parameter, welche im Verlauf der Entwicklung optimiert wurden, waren u.a. der Gas Fluss, die Einbauhöhe des Interface und die FID Temperatur. Das entwickelte Interface wurde durch Messung von diversen aus der Literatur bekannten Substanzen getestet. Eine lineare Korrelation von Kohlenstoffgehalt und FID Response wurde bei 21 untersuchten N-Heterozyklischen Verbindungen und sechs Alkoholen nachgewiesen. Die Korrelation für alle untersuchten Substanzen lag hierbei zwischen R² 0.991 und 0.999. Die Nachweisgrenzen der heterozyklischen Verbindungen lagen zwischen 0.24 ng (Pyrimidin-n-oxyd) und 1.24 ng (s-Triazin) absolut injizierte Substanzmenge. Die chromatographische Auftrennung der untersuchten Alkohole zeigte eine deutliche Verbesserung der Nachweisgrenzen mit Hilfe des hier präsentierten Interface auf 0.28 ng (Ethanol) im Vergleich zu bestehenden LC/FID Systemen. In der zweiten Sektion der Arbeit wurden die der Analyse zugrundeliegenden Responseberechnungen und einige theoretische Responsevorhersagemodelle diskutiert. Der Fokus der angewandten Response Modelle lag auf der experimentellen effektiven Kohlenstoffzahl (ECNEXP) [2, 3] und der experimentellen relativen Sensitivität (RFExp) [2, 4]. Die Einflüsse verschiedener funktioneller Gruppen wie beispielsweise OH-Gruppen, Halogene und Ketone wurde in der zweiten Sektion mit Bezug auf publizierte GC/FID Studien diskutiert. Hierbei konnte festgestellt werden, dass der Einfluss der OH-Gruppe in mono-substituierten Alkoholen mit steigender Kohlenstoffzahl von C1 bis C7 deutlich abnimmt. Die Studien haben gezeigt, dass nicht nur der Substituent, sondern die Position innerhalb einer Verbindung einen signifikanten Einfluss auf das Responseverhalten einer Verbindung hat. Die aus der Literatur bekannten Verbrennungsprozesse für verschiedene Verbindungen wurden verwendet, um einen detaillierteren Einblick auf die erhaltenen Unterschiede im Responseverhalten von beispielsweise Pyrimidin und Pyridazin zu erhalten. Die Diskrepanzen zwischen theoretischen und experimentellen Werten für Isomere konnten so aufgezeigt werden. Gängige theoretische Responseberechnungsmodelle berücksichtigen diese Unterschiede von Isomeren bisher nicht. Abschließend wurden die in dieser Arbeit erhaltenen experimentellen Responsedaten mit den experimentellen Werten aus GC/FID Responsestudien verglichen. Diese Arbeit bedeutet einen großen Schritt für die Analyse von volatilen und nicht-volatilen Substanzen mittels LC/FID. Erstmals wurden die LC/FID Responsen von mehr als hundert verschiedenen Substanzen gemessen und wenn möglich mit den Responsedaten aus GC/FID Responsestudien verglichen. Die Bandbreite an GC und LC fähigen Substanzen ist jedoch groß, daher wird es in zukünftige Projekten notwendig sein noch weitere Verbindungen zu analysieren und die erhaltenen Responsedaten mit denen aus GC/FID Studien zu vergleichen. Um eine Akzeptanz der hier vorgestellten Detektion und der damit verbundenen semi-quantitativen Analyse von Nebenprodukten während der Synthese von z.B. pharmazeutischen Produkten zu schaffen, ist es notwendig, weitere Studien im Gebiet der pharmazeutischen Industrie durch zu führen.

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Becker, C., 2019. Development of a thermospray nebulizer interface for liquid chromatography with flame ionization detection and detector response studies of volatile and non-volatile compounds. https://doi.org/10.17185/duepublico/70525
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