Regulation der Chondrozytendifferenzierung durch Atoh8

Schröder, Nadine GND

Das Vertebratenskelett stabilisiert den Körper, schützt die lebenswichtigen inneren Organe und ermöglicht im Zusammenspiel mit der Muskulatur die Bewegung. Um diese Funktionen erfüllen zu können, sind die korrekte Bildung sowie ein ausgewogenes Wachstum der einzelnen Skelettelemente entscheidend. Die meisten Skelettelemente entstehen durch enchondrale Ossifikation, indem zunächst eine Knorpelanlage angelegt wird, die anschließend durch Knochen ersetzt wird. Dabei ist die Balance zwischen Proliferation und hypertropher Differenzierung der Knorpelzellen (Chondrozyten) von entscheidender Bedeutung für die korrekte Entwicklung der Knochen (Wuelling und Vortkamp, 2011). Der Transkriptionsfaktor Atonal homolog (Atoh)8 wird während der Embryonalentwicklung in verschiedenen Organen exprimiert und ist dort an der Regulation der Proliferation und der Differenzierung spezifischer Zelltypen beteiligt (Balakrishnan-Renuka et al., 2014; Ejarque et al., 2016; Inoue et al., 2001; Ross et al., 2006). Eine Microarray-Analyse der Genexpression in der Wachstumsfuge des Huhns lieferte außerdem Hinweise auf eine Expression von Atoh8 in Chondrozyten (Horvat-Gordon et al., 2010). Auf Grundlage dessen wurden in dieser Studie die Expression und die Funktion des Transkriptionsfaktors während der enchondralen Ossifikation analysiert. Mittels in situ Hybridisierung wurde gezeigt, dass Atoh8 in der Maus bereits in den frühen Knorpelanlagen und während der weiteren Entwicklung sowohl in den proliferierenden als auch den hypertrophen Chondrozyten exprimiert wird. Dabei ist die Expression in den prähypertrophen Chondrozyten und somit bei der Einleitung des Differenzierungsprozesses erhöht. Zur Charakterisierung der regulativen Funktion wurde Atoh8 in der Maus entweder Chondrozyten-spezifisch (Atoh8flox/flox;Col2a1-Cre) oder ubiquitär (Atoh8flox/flox;Prx1-Creweiblich) deletiert, um zwischen Defekten während der Kondensation der Mesenchymzellen und der Chondrogenese unterscheiden zu können. Die Atoh8 Deletion führt in beiden Mauslinien zu verkürzten Knochen. Obwohl der Phänotyp in den Atoh8flox/flox;Col2a1-Cre Mäusen erst postnatal, in den Atoh8flox/flox;Prx1-Creweiblich Mäusen jedoch bereits pränatal auftritt, ist die mesenchymale Kondensation durch den Atoh8 Verlust nicht beeinträchtigt. Stattdessen wurden in beiden Mauslinien eine verringerte Proliferationsrate und eine beschleunigte Differenzierung der Chondrozyten als Ursachen für das reduzierte Längenwachstum der Knochen identifiziert. In Chondrozyten ist Atoh8 demnach ein positiver Regulator der Proliferation und ein negativer Regulator der hypertrophen Differenzierung. Um Atoh8 in das regulative Netzwerk der Chondrogenese zu integrieren, wurde zunächst eine funktionale Interaktion mit der Phosphatase Calcineurin analysiert. Calcineurin ist ebenfalls ein Regulator der Chondrozytendifferenzierung und es wurde gezeigt, dass die Phosphatase die nukleäre Lokalisation von Atoh8 in Human Embryonic Kidney (HEK)-Zellen kontrolliert (Chen et al., 2016; Matta et al., 2014; Tomita et al., 2002). In Chondrozyten konnte jedoch keine Lokalisationsänderung von Atoh8 aufgrund einer Calcineurin Inhibierung gezeigt werden. Basierend auf ähnlichen regulativen Funktionen in Chondrozyten wurde außerdem ein Zusammenhang zwischen Atoh8 und dem Signalmolekül Indian hedgehog (Ihh) untersucht. Ihh ist ein wichtiger Regulator der Chondrozytenproliferation und des Einsetzens der hypertrophen Differenzierung (Karp et al., 2000; Lanske at al., 1996; St-Jacques et al., 1999; Vortkamp et al., 1996). Interessanterweise wird Atoh8 verstärkt in den Ihh-exprimierenden, prähypertrophen Chondrozyten exprimiert. In Gliedmaßen-Kulturen konnte gezeigt werden, dass Atoh8 das Einsetzen der hypertrophen Differenzierung upstream von Ihh reguliert. In Übereinstimmung damit, ist die Ihh Expression in Atoh8-defizienten Mäusen verringert. Demnach hemmt Atoh8 die Differenzierung, indem der Transkriptionsfaktor die Ihh Expression aktiviert. Im Gegensatz zum Einsetzen der Differenzierung reguliert Atoh8 die Chondrozytenproliferation downstream von Ihh. Eine physikalische Interaktion mit dem Transkriptionsfaktor Gli3, einem Haupteffektor der Ihh-Signale in Chondrozyten, konnte allerdings nicht nachgewiesen werden. Um das Interaktom von Atoh8 global zu untersuchen und damit zum besseren Verständnis der Regulationsmechanismen beizutragen, wurden die Bindungspartner nach einer Immunpräzipitation mittels Massenspektrometrie analysiert. In diesem Screening konnte die Untereinheit H des Translationsinitiationsfaktors eIF3 (eIF3H) als neuer Interaktionspartner identifiziert werden. Es gibt Hinweise darauf, dass eIF3H nicht für die generelle Translationsinitiation benötigt wird, stattdessen aber die Translation spezifischer mRNAs reguliert (Choudhuri et al., 2010; Kim et al., 2004). In dieser Arbeit wurde eine Ko-Lokalisation von Atoh8 und eIF3H im Zytoplasma, vermutlich im rauen Endoplasmatischen Retikulum, dem Ort der Proteinbiosynthese, gezeigt. Möglicherweise reguliert Atoh8 die Expression seiner Zielgene also nicht nur auf transkriptioneller sondern auch auf translationaler Ebene. Für eine funktionale Charakterisierung der Interaktion sind jedoch weiterführende Experimente notwendig

The skeleton of vertebrates provides stability, protects inner organs and, in cooperation with muscles, enables movement. To fulfill these functions proper formation and growth of all skeletal elements are necessary. Most bones develop by endochondral ossification, during which a cartilage template is formed and subsequently replaced by bone. To ensure proper development, proliferation and hypertrophic differentiation of cartilage cells (chondrocytes) has to be balanced (Wuelling und Vortkamp, 2011). The transcription factor Atonal homolog (Atoh)8 is expressed in several organs during embryonic development, where it regulates proliferation and differentiation of specific cell types (Balakrishnan-Renuka et al., 2014; Ejarque et al., 2016; Inoue et al., 2001; Ross et al., 2006). A microarray analysis of gene expression in the avian growth plate detected Atoh8 expression in chondrocytes (Horvat-Gordon et al., 2010). Based on these data, the expression and function of Atoh8 during endochondral ossification were investigated in this study. In situ hybridization revealed that in mice Atoh8 is expressed in the early cartilage anlagen and later in proliferating as well as hypertrophic chondrocytes with an increased expression in early differentiated, prehypertrophic chondrocytes. For characterizing its function during endochondral ossification, Atoh8 was deleted either chondrocyte-specific (Atoh8flox/flox;Col2a1-Cre) or ubiquitous (Atoh8flox/flox;Prx1-Creweiblich) to discriminate between defects in mesenchymal condensation and chondrocyte differentiation. In both mouse strains, Atoh8 deletion leads to a reduced size of endochondral bones. Although the phenotype occurs in Atoh8flox/flox;Col2a1-Cre mice at postnatal and in Atoh8flox/flox;Prx1-Creweiblich mice at prenatal stages, the mesenchymal condensations are not affected by loss of Atoh8. Instead, the reduced longitudinal bone growth is based on a decreased proliferation rate and an accelerated differentiation in Atoh8flox/flox;Col2a1-Cre and in Atoh8flox/flox;Prx1-Creweiblich mice. Thereby, Atoh8 was identified as a positive regulator of proliferation and a negative regulator of hypertrophic differentiation in chondrocytes. To integrate Atoh8 into the regulative network of chondrogenesis, a functional interaction with the phosphatase Calcineurin was investigated. Calcineurin is also a regulator of chondrocyte differentiation and has been shown to regulate the nuclear localization of Atoh8 in Human Embryonic Kidney (HEK) cells (Chen et al., 2016; Matta et al., 2014; Tomita et al., 2002). However, Calcineurin inhibition does not influence Atoh8 localization in chondrocytes. Additionally, an interaction between Atoh8 and the signaling molecule Indian hedgehog (Ihh) was analyzed based on their comparable regulative functions in chondrocytes. Ihh is an important regulator of chondrocyte proliferation and the onset of hypertrophic differentiation (Karp et al., 2000; Lanske at al., 1996; St-Jacques et al., 1999; Vortkamp et al., 1996). Interestingly, Atoh8 expression is increased in Ihh expressing, prehypertrophic chondrocytes. The results of limb culture experiments suggest that Atoh8 modulates the onset of hypertrophic differentiation upstream of Ihh. In line with this, Ihh expression is reduced in Atoh8-deficient mice indicating that the transcription factor inhibits differentiation by activating Ihh expression. In contrast to the effect of Atoh8 on the onset of differentiation, Atoh8 regulates chondrocyte proliferation downstream of Ihh. However, a physical interaction with the transcription factor Gli3, the main effector of Ihh signals in chondrocytes, was not detected. To characterize the interactome of Atoh8 in an unbiased approach, immunoprecipitation followed by mass-spectrometry of the bound proteins was performed. Using this screen, the subunit H of the translation initiation factor eIF3 (eIF3H) was identified as a new interaction partner. As several studies demonstrate, eIF3H regulates the translation of specific mRNAs rather than being needed for global translation initiation (Choudhuri et al., 2010; Kim et al., 2004). In this study a co-localization of Atoh8 and eIF3H was detected in the cytoplasm, probably in the rough endoplasmic reticulum, where protein biosynthesis takes place. Atoh8 might thus regulate the expression of its target genes not only on transcriptional, but also on translational level. However, further experiments are necessary for a functional characterization of this protein interaction.

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Schröder, N., 2020. Regulation der Chondrozytendifferenzierung durch Atoh8. https://doi.org/10.17185/duepublico/70192
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