The crucial role of sphingosine-1-phosphate and the therapeutic potential of fingolimod for Graves´ disease and associated orbitopathy

Graves´ disease (GD) is an autoimmune disorder caused by stimulating autoantibodies against the thyrotropin stimulating hormone receptor (TSHR) resulting in hyperthyroidism. The most common complication of GD is Graves´ orbitopathy (GO) as a result of the binding of autoantibodies to TSHR in the orbital tissue. The main features of GO include orbital inflammation, adipogenesis and fibrosis of extraocular muscles. Orbital fibroblasts (OFs) play a crucial role in the pathogenesis of GO and function as effector cells. They can be activated by the binding of antibodies to TSHR or by the ligation of T cells via CD40/CD40L. The activation of OFs results in proliferation, differentiation into adipocytes or myofibroblasts and/or hyaluronan production leading to the characteristics of the disease. While thyroid dysfunction can be efficiently treated with anti-thyroid drugs, current treatments for GO remain unsatisfactory. Since GO has a huge impact on the life quality of patients, there is a strong need for the identification of new therapeutic targets and efficient treatment. The work presented in this thesis addressed the role of the sphingolipid sphingosine-1-phosphate (S1P) in the pathogenesis of GO, especially the impact on T-cell migration towards human OFs. Furthermore, the S1P receptor modulator fingolimod was investigated for its preventive and therapeutic potential in an experimental GD/GO mouse model. In the first part of this thesis, increased S1P levels were found in GO patients´ orbital tissue. Moreover, stimulation of OFs derived from GO patients with CD40L to mimic an inflammatory environment, led to enhancement of S1P levels in comparison to OFs derived from non-GO control persons. Further analyses revealed that the sphingolipid pathway is upregulated in GO OFs upon CD40L stimulation: Other sphingolipids like ceramide and sphingosine, as well as involved enzyme activities such as acid sphingomyelinase (ASM) and sphingosine kinase (SphK) were increased in the diseased cells. Since S1P is well known as a chemoattractant for T cells and responsible for their egress from lymphoid organs, T-cell migration assays were performed. The results demonstrated that stimulation of GO OFs with CD40L resulted in increased T-cell migration, independent from diseased or healthy origin of the T cells. The use of a SphK inhibitor led to total inhibition of this effect, indicating a strong role for S1P in T-cell recruitment during GO pathogenesis. The results of the study suggested a vicious cycle: The initial binding of T cells to OFs leads to an activation of the cells and an upregulation of the sphingolipid pathway resulting in increased S1P levels. S1P accumulation results in enhanced T-cell migration towards OFs and to further activation of the cells. Since we identified S1P to be involved in T-cell recruitment in the pathogenesis of GO, we investigated the preventive and therapeutic potential of fingolimod in a GD/GO mouse model. The immunosuppressant fingolimod is a FDA-approved S1P receptor modulator used for the treatment of multiple sclerosis. The GD/GO mouse model is based on four immunizations with a plasmid encoding for the A-subunit of human TSHR. One group of TSHR mice remained untreated, whereas the preventively treated group received fingolimod from the first immunization onwards and the therapeutically treated group received fingolimod after the fourth immunization onwards. As control, another group of mice was immunized with a β-galactosidase plasmid. Six weeks after the last immunization, the experiment was terminated. Most importantly, preventive fingolimod treatment inhibited the formation of autoantibodies against TSHR. Furthermore, fingolimod treatment either preventively or therapeutically resulted in a dramatically reduction of CD3+, CD4+ and CD8+ T cells in peripheral blood of the mice without affecting CD19+ B cells. In the spleen, CD4+, CD8+ and effector T cells were also decreased. The analysis of thyroid morphology revealed a reduction of hyperplastic follicles in both fingolimod treated groups and seral T4 concentrations were decreased to control levels upon preventive treatment. No CD3+ T-cell infiltration into the thyroids could have been observed in both fingolimod treated groups. The improvement of hyperthyroidism is in line with results obtained in the living animals: fingolimod treated mice show no or less increase in body temperature and weight gain, as well as heart rate and cardiac output on control levels. The efficacy of fingolimod on orbitopathy was determined by histological analyses. Similar to the thyroid, no CD3+ T-cell infiltration into the orbital tissue could have been detected in fingolimod treated animals. The increase of the percentage of orbital brown fat in untreated TSHR mice could have been blocked partially in preventively fingolimod treated mice, as well as hyaluronan deposition. The total outcome of GD and GO was determined via z-scoring. It revealed that preventive fingolimod was able to inhibit GD in 100% and GO in 86% of the mice. Therapeutic fingolimod treatment resulted in an inhibition of GD and GO in 57% of the animals, whereas most of the mice, which developed GD and/or GO were only mild affected. In conclusion, the results in this thesis revealed a crucial role for S1P in T-cell recruitment during the development of GO. Moreover, fingolimod, a S1P receptor modulator was efficient in preventive and partially therapeutic treatment of GD and GO. Fingolimod should be investigated in clinical trials for its efficacy in patients as early treatment of GD and GO.

Morbus Basedow (Graves´ disease) ist eine autoimmune Schilddrüsenerkrankung, die durch stimulierende Autoantikörper ausgelöst wird, die gegen den Thyreotropin-stimulierenden Hormonrezeptor (TSHR) gerichtet sind, was eine Hyperthyreose zur Folge hat. Die Endokrine Orbitopathie (EO, Graves´ orbitopathy) ist eine extrathyroidale Manifestation des Morbus Basedow und wird durch die Bindung der Autoantikörper an den TSHR im orbitalen Gewebe ausgelöst. Die EO ist gekennzeichnet durch orbitale Entzündungsreaktionen, Ausbreitung des retroorbitalen Fettgewebes, sowie Fibrose der extraokulären Muskeln. Orbitalfibroblasten (OFs) haben eine Schlüsselrolle während der Pathogenese der EO inne und wirken als Effektor-Zellen. Sie können durch die Bindung von Antikörpern an den TSHR, sowie die Bindung von T-Zellen via CD40/CD40L, aktiviert werden. OF Aktivierung kann zu Proliferation, Differenzierung in Adipozyten oder Myofibroblasten und/oder zur Hyaluronsäure-Produktion führen. Während Morbus Basedow inzwischen effektiv behandelt werden kann, ist die Therapie für EO bis zu diesem Zeitpunkt unbefriedigend. Da EO Patienten durch die Krankheit sehr stark in Bezug auf ihre Lebensqualität eingeschränkt sind, besteht ein dringender Bedarf nach effizienter Behandlung. Das Projekt, das dieser Doktorarbeit zu Grunde liegt, bezog sich zunächst auf die Identifizierung der Rolle des Sphingolipid Sphingosin-1-Phosphat (S1P) in der EO Pathogenese, insbesondere auf dessen Einfluss auf die Migration von T-Zellen Richtung humaner OFs. Des Weiteren wurde der S1P Rezeptormodulator Fingolimod hinsichtlich seiner präventiven und therapeutischen Wirkung in einem experimentellen Morbus Basedow/EO Mausmodell untersucht. Im ersten Teil dieser Dissertation wurden erhöhte S1P Level im orbitalen Gewebe von EO Patienten gefunden. Des Weiteren führte die Stimulation von EO OFs mit CD40L, als Nachahmung einer entzündlichen Umgebung, zu erhöhten S1P Werten im Vergleich zu OFs, die von gesunden Personen gewonnen wurden. Weitere Analysen zeigten, dass der Sphingolipid Stoffwechsel in EO OFs nach CD40L Stimulation hochreguliert war: Andere Sphingolipide, wie Ceramid oder Sphingosin waren erhöht, aber auch involvierte Enzyme, wie die saure Sphingomyelinase (ASM) oder Sphingosin Kinase (SphK) zeigten erhöhte Aktivität in den erkrankten Zellen. Da S1P bereits als Lockstoff für T-Zellen bekannt ist, wurden T-Zell Migrationsassays durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen eine deutlich erhöhte Migration Richtung der mit CD40L stimulierten EO OFs. Hierbei machte es keinen Unterschied, ob die T-Zellen einen EO oder einen gesunden Ursprung hatten. Der Gebrauch eines SphK Inhibitor führte zu einer Inhibierung dieses Effekts, was eine wichtige Rolle von S1P für die T-Zell Migration während der EO Entwicklung indizierte. Aufgrund dieser Ergebnisse gingen wir von einem Teufelskreis aus: Die initiale Bindung von T-Zellen an OFs führt zu einer Aktivierung der Zellen und zu einer Hochregulierung des Sphingolipid Stoffwechsels und letztlich zu erhöhten S1P-Level. Lokal erhöhte S1P-Level verursachen eine vermehrte Migration von T-Zellen in Richtung der OFs und eine Aktivierung weiterer OFs. Nachdem S1P als wichtiges Element für die T-Zell Rekrutierung während der EO Entwicklung in vitro identifiziert werden konnte, wurde das präventive und therapeutische Potential von Fingolimod an einem Morbus Basedow/EO Mausmodell untersucht. Das bereits zugelassene immunsuppressive Medikament Fingolimod ist ein S1P Rezeptormodulator und wird für die Behandlung von Patienten verwendet, die an Multipler Sklerose leiden. Unser Mausmodell basiert auf 4 Immunisierungen mit einem Plasmid, das für die A-Untereinheit des humanen TSHR codiert. Eine TSHR Mausgruppe blieb unbehandelt, eine Mausgruppe erhielt Fingolimod präventiv ab der ersten Immunisierung und eine Gruppe erhielt Fingolimod therapeutisch ab der letzten Immunisierung. Als Kontrolle wurde eine weiter Mausgruppe mit einem β-Galaktosidase Plasmid immunisiert. 6 Wochen nach der letzten Immunisierung wurde das Experiment beendet. Hervorzuheben ist, dass durch die präventive Behandlung mit Fingolimod die Bildung von Autoantikörpern gegen den TSHR verhindert werden konnte. Des Weiteren führte präventive sowie therapeutische Behandlung zu einer deutlichen Reduktion von CD3+, CD4+ und CD8+ T-Zellen im peripheren Blut, ohne dabei den Anteil an B-Zellen zu verändern. In der Milz konnten durch Fingolimod CD4+, CD8+ und Effektor-T-Zellen reduziert werden. Die histologische Analyse der Schilddrüsen ergab eine Reduktion hyperplastischer Follikel in beiden behandelten Gruppen und Serum-T4 Konzentrationen waren auf Kontrollniveau nach präventiver Fingolimod Therapie. Außerdem konnten keine CD3+ T-Zell-Infiltrationen ins Schilddrüsengewebe der behandelten Tiere festgestellt werden. Diese Verbesserung der Hyperthyreose passt zu Werten, die bereits in lebenden Tieren festgestellt werden konnten: Die Behandlung mit Fingolimod führte zu einer Verhinderung der krankhaften Gewichtszunahme, der Erhöhung der Körpertemperatur, sowie Erhöhung der Herzrate und der Herzleistung. Zur Analyse der Wirksamkeit von Fingolimod auf die EO, wurden histologische Untersuchungen des orbitalen Gewebes durchgeführt. Ähnlich, wie bei der Schilddrüse konnten CD3+ T-Zell-Infiltrationen nach Fingolimod Behandlung verhindert werden. Der Anstieg des braunen Fett Anteils in unbehandelten Mäusen konnte teilweise durch präventive Fingolimod Behandlung verhindert werden, gleiches galt für die Hyaluronsäure Produktion. Der Einfluss von Fingolimod auf die Gesamtausprägung und den Schweregrad von Morbus Basedow und EO wurde via Z-Scoring bestimmt. Hierbei zeigte sich, dass in präventiv behandelten Mäusen Morbus Basedow zu 100% und EO zu 86% verhindert werden konnte. Therapeutische Behandlung mit Fingolimod führte in jeweils 57% der Tiere zu einer Verhinderung von Morbus Basedow und EO. Die Tiere, die dennoch erkrankten, litten in den meisten Fällen nur noch an einer leichten Erkrankung. Zusammengefasst zeigten die Resultate dieser Dissertation, dass S1P eine wichtige Rolle in der Pathogenese der EO spielt, insbesondere als Lockstoff für T-Zellen. Des Weiteren konnte die präventive und therapeutische Wirksamkeit von Fingolimod, einem S1P Rezeptormodulator, an einem Morbus Basedow/EO Mausmodell gezeigt werden. Fingolimod sollte daher in klinischen Studien auf die Wirksamkeit bei Morbus Basedow und EO Patienten untersucht werden und als frühe Behandlungsmethode in Betracht gezogen werden.


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