Studien zu der Prolyl-Isomerase Par45 aus Leishmania major

Hönig, Dana GND

Die Peptidyl-Prolyl-cis/trans Isomerasen (PPIasen) sind Enzyme, die die Rotation der Peptidyl-Prolyl-Bindung vom cis- zum trans-Isomer katalysieren. Die PPIasen sind in allen Domänen des Lebens vertreten und sind in Prozesse wie die Proteinfaltung, die Signaltransduktion oder den Transport und Abbau von Proteinen involviert.
Neben den Phosphat-abhängigen und Phosphat-unabhängigen Parvulinen wurde im letzten Jahrzehnt eine neue Gruppe an Parvulinen entdeckt, die Par45-zugehörigen Parvuline (Erben et al., 2010). Diese Mehrdomänen-Parvuline verfügen über eine N-terminale FHA-Domäne, die über einen unstrukturierten Linker mit einer C-terminalen PPIase-Domäne verbunden ist (Rehic, 2016). Die Kristallstrukturen der PPIase-Domänen aus T. brucei (TbPar42) und L. major (LmPar45) lieferten erste Einblicke ins aktive Zentrum auf atomarer Ebene. Sie weisen eine typische Parvulin-Topologie auf, wobei sie strukturell eher den Phosphat-abhängigen Parvulinen ähneln.
Im Isomeraseassay konnte keine Enzymaktivität für phosphorylierte- und unphosphorylierte-Modellpeptide nachgewiesen werden, so dass von einer inaktiven PPIase ausgegangen werden muss. Während das LmPar45 überwiegend im Zellkern lokalisiert war, befanden sich das LmPin1 und das TbPar14 eher im Zytosol. Lokalisierungsexperimente mit verkürzten LmPar45-Konstrukten machten deutlich, dass die FHA-Domäne für die Lokalisierung im Zellkern benötigt wird. Besonders auffällig war das sowohl LmPar45 sowie LmPin1 und TbPar14 auch in der Spitze des Flagellums detektiert werden konnte, was auf eine generelle Funktion in der Flagellen/Cillien-Biogenese hindeuten könnte.
Um Interaktome zu erstellen, wurden Eluate aus den Pulldown Experimenten mit den rekombinanten Parvulinen LmPar45, LmPin1 und TbPar14 massenspektrometrisch untersucht. Anders als bei LmPin1 und TbPar14, für die keine Interaktionspartner identifiziert wurden, konnte für das LmPar45 ein umfassendes Interaktom erstellt werden. Aus dem LmPar45 Interaktom wurde eine Liste mit möglichen Bindungspartnern erstellt, die zum ersten Mal Hinweise auf die Funktion der neuen Par45-Gruppe lieferte. Es wurden mehrere Proteine identifiziert, die im Spleißen von mRNA involviert sind. Darunter befanden sich vermehrt Komponenten der U4/U6, U5 snRNPs, die einen ähnlich hohen Anreicherungsfaktor wie das LmPar45 besaßen.
Neben den Proteinen, die im Spleißing involviert sind, wurde auch eine Vielzahl an unterschiedlichen RNA-bindenden Proteinen im Interaktom identifiziert, was eventuell auch auf eine direkte Interaktion von LmPar45 mit RNA-Molekülen hindeutet. Auffällig war auch, dass einige Proteine der snoRNA Biogenese bzw. des HSP90/R2TP Chaperon-Cochaperon-Systems gefunden wurden. Die snoRNPs sind essentiell für Prozesse wie die RNA-Prozessierung, das Spleißen von mRNA, das RNA-Editing und den Erhalt von Chromatin. Dies deutet auf eine generelle Funktion des LmPar45 in der RNA-Prozessierung hin.

Peptidyl-prolyl-cis/trans-isomerases (PPIases) are enzymes that catalyze the isomerization of peptidyl prolyl bonds from cis- to trans-isomer. PPIases are represented in all domains of life and involved in processes such as protein folding, signal transduction, protein transport or degradation.
In the last decade, a new group of the PPIase familiy, the Par45-related parvulins, has been identified (Erben et al., 2010). Those multi-domain parvulins contain an N-terminal FHA domain linked by an unstructured linker region to a C-terminal PPIase domain (Rehic, 2016). The two crystal structures of the PPIase domains from TbPar42 and LmPar45, solved in this work, provided first insights into the catalytic centres. Although the LmPar45 and TbPar42 PPIase domains exhibit a parvulin topology and a high structural homology to the human phosphospecific parvulin representative Pin1, no isomerase activity for potential phosphorylated and unphosphorylated peptides was found. Thus, we conclude that both PPIase domains of TbPar42 and LmPar45 are likely catalytically inactive.
Whereas LmPar45 posesses predominantly a nuclear localization, LmPin1 and TbPar14 were detected in the cytosol. Truncated LmPar45-constructs showed a cytosolic localization if the FHA domain was absent. Interestingly a localization signal within the tip of the flagellum was detected for LmPar45 as well as LmPin1 and TbPar14, pointing out a general function of those parvulins in cillium biogenesis.
In order to investigate interactomes, eluates of pulldown experiments including the recombinant parvulins LmPar45, LmPin1, TbPar14 were analyzed by mass spectrometry. Whereas no interactors were identified for LmPin1 and TbPar14, a comprehensive interactome of LmPar45 was generated. The LmPar45 interactome reveals for the first time a list of potential interaction partners, thus insights of the biological function Par45-related parvulins. Serveral proteins within the LmPar45 interactome were involved in mRNA-splicing. These include especially components of the U4/U6, U5 snRNPs which occur by the same factor as LmPar45. Beside the group of proteins involved in splicing, a group of various RNA-binding proteins were identified within the LmPar45 interactome, which could be a hint for direct RNA-binding. Furthermore, proteins involved in snoRNA biogenesis, like HSP90/R2TP chaperon system pathways, were part of the LmPar45 interactome. SnoRNPs play an essential role in processes such as RNA processing, splicing of mRNA, RNA editing and chromatin maintenance, pointing to a more general biological function of LmPar45 in RNA-Processing.

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Hönig, D., 2021. Studien zu der Prolyl-Isomerase Par45 aus Leishmania major. https://doi.org/10.17185/duepublico/70019
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