Immobilisierung anionischer Biomoleküle in ladungsinvertierten Polycarboxylatbeschichtungen
Die kovalente Immobilisierung von Biomolekülen durch Carbodiimide in Kombination mit N-Hydroxysuccinimid (NHS) in dreidimensionalen, überwiegend polycarboxylatbasierten Schichten, der sogenannten Immobilisierungsmatrix, ist ein verbreitetes Verfahren in der Biosensorik und der Affinitätschromatographie. Voraussetzung für die effiziente kovalente Kopplung ist eine ausreichende Nähe zwischen reaktiven, oberflächengebundenen Gruppen, typischerweise NHS-aktivierte Carboxygruppen, und Biomolekül. Bei geringen Ionenstärken führt die elektrostatische Anziehung zwischen positiv geladenem Biomolekül und negativ geladener Beschichtung zu einer Anreicherung innerhalb der Immobilisierungsmatrix; ein Effekt der als elektrostatische Vorkonzentrierung bezeichnet wird. Sobald das Biomolekül vorkonzentriert ist, kann im Anschluss die kovalente Kopplung erfolgen. Allerdings ist die beschriebene Methode ineffizient bei sauren Biomolekülen, da die sauren, polycarboxylatbasierten Immobilisierungsmatrizen ab pH 4,5 einem ausgeprägten Ladungsverlust unterliegen (pKs ≈ 4,5) und die sauren Liganden ihrerseits nur bei entsprechend niedrigen pH-Werten eine positive Nettoladung aufweisen.
In dieser Arbeit wird am Beispiel eines Oberflächenplasmonenresonanz- (SPR-) Biosensors eine Lösung für die beschriebene Problemstellung entwickelt. Zu diesem Zweck wird zunächst eine geeignete Ausgangsbeschichtung auf Basis von linearem Natriumpolyacrylat etabliert und hinsichtlich ihrer elektrostatischen Proteinadsorptionskapazität, Eluierbarkeit, Schichtdicke, Messfeldabdeckung, Hydrolysestabilität, Permeabilität und Quellungseigenschaften charakterisiert.
Im Anschluss wird die polyanionische Immobilisierungsmatrix mit einem asymmetrischen Diamin derivatisiert, wobei ausreichend hohe Derivatisierungsgrade erzielt werden, um die negative Nettoladung der Sensorbeschichtung in den positiven Bereich zu verschieben. Dies ermöglicht eine sogenannte inverse elektrostatische Vorkonzentrierung, welche sich dadurch auszeichnet, dass der zu immobilisierende Ligand eine negative und die Immobilisierungsmatrix eine positive Nettoladung aufweist. Durch eine Modifikation der Derivatisierungsmethode lässt sich die inverse elektrostatische Vorkonzentrierung mit einer kovalenten Ligandenkopplung kombinieren und in die vollautomatische Fluidik eines SPR-Spektrometers integrieren. Mit Protein A als saurem Modellligand wird die neue Kopplungsmethode validiert und die Immobilisierungsbedingungen insofern optimiert, dass hohe Immobilisierungsausbeuten als auch geringe unspezifische Wechselwirkungen der Chipoberfläche resultieren. Neben der effizienten kovalenten Kopplung saurer Proteine erlaubt die entwickelte Methode erstmals die elektrostatische Vorkonzentrierung und kovalente Immobilisierung von Nukleinsäuren in polycarboxylatbasierten Sensorbeschichtungen. Das Potential SPR-basierter Nukleinsäure-Biosensoren unter Verwendung der inversen elektrostatischen Vorkonzentrierung wird anhand eines Hybridisierungsexperiments zur Quantifizierung einzelsträngiger DNA demonstriert, wobei eine 8,6-mal höhere Sensitivität gegenüber dem bislang verwendeten Stand der Technik erzielt wird. Weiterhin wird im Rahmen einer biomolekularen Interaktionsanalyse mit niedermolekularen DNA-Interkalatoren die Validität und Empfindlichkeit entsprechender DNA-Biosensoren zur Bestimmung kinetischer Gleichgewichtskonstanten aufgezeigt.
In dieser Arbeit wird am Beispiel eines Oberflächenplasmonenresonanz- (SPR-) Biosensors eine Lösung für die beschriebene Problemstellung entwickelt. Zu diesem Zweck wird zunächst eine geeignete Ausgangsbeschichtung auf Basis von linearem Natriumpolyacrylat etabliert und hinsichtlich ihrer elektrostatischen Proteinadsorptionskapazität, Eluierbarkeit, Schichtdicke, Messfeldabdeckung, Hydrolysestabilität, Permeabilität und Quellungseigenschaften charakterisiert.
Im Anschluss wird die polyanionische Immobilisierungsmatrix mit einem asymmetrischen Diamin derivatisiert, wobei ausreichend hohe Derivatisierungsgrade erzielt werden, um die negative Nettoladung der Sensorbeschichtung in den positiven Bereich zu verschieben. Dies ermöglicht eine sogenannte inverse elektrostatische Vorkonzentrierung, welche sich dadurch auszeichnet, dass der zu immobilisierende Ligand eine negative und die Immobilisierungsmatrix eine positive Nettoladung aufweist. Durch eine Modifikation der Derivatisierungsmethode lässt sich die inverse elektrostatische Vorkonzentrierung mit einer kovalenten Ligandenkopplung kombinieren und in die vollautomatische Fluidik eines SPR-Spektrometers integrieren. Mit Protein A als saurem Modellligand wird die neue Kopplungsmethode validiert und die Immobilisierungsbedingungen insofern optimiert, dass hohe Immobilisierungsausbeuten als auch geringe unspezifische Wechselwirkungen der Chipoberfläche resultieren. Neben der effizienten kovalenten Kopplung saurer Proteine erlaubt die entwickelte Methode erstmals die elektrostatische Vorkonzentrierung und kovalente Immobilisierung von Nukleinsäuren in polycarboxylatbasierten Sensorbeschichtungen. Das Potential SPR-basierter Nukleinsäure-Biosensoren unter Verwendung der inversen elektrostatischen Vorkonzentrierung wird anhand eines Hybridisierungsexperiments zur Quantifizierung einzelsträngiger DNA demonstriert, wobei eine 8,6-mal höhere Sensitivität gegenüber dem bislang verwendeten Stand der Technik erzielt wird. Weiterhin wird im Rahmen einer biomolekularen Interaktionsanalyse mit niedermolekularen DNA-Interkalatoren die Validität und Empfindlichkeit entsprechender DNA-Biosensoren zur Bestimmung kinetischer Gleichgewichtskonstanten aufgezeigt.
The carbodiimide/N-hydroxysuccinimide (NHS)-mediated covalent immobilization of biomolecules in three-dimensional, predominantly polycarboxylate-based coatings, the so called immobilization matrix, is widely used in biosensor preparation and affinity chromatography. Efficient covalent immobilization relies on generating a sufficient proximity between surface bound reactive groups, typically NHS-activated carboxylates, and the biomolecule. Under low ionic strength conditions, electrostatic attraction between a positively charged biomolecule and the negatively charged surface leads to the accumulation of the biomolecule inside the sensor matrix, an effect called electrostatic preconcentration. Once the biomolecule is electrostatically preconcentrated, covalent immobilization can proceed. However, it is a notoriously inefficient coupling chemistry for acidic biomolecules because they need acidic conditions to exhibit a positive net charge while the weakly acidic polycarboxylate-based immobilization matrix suffers from a pronounced loss of charge density for pH < 4.5 (pKa ≈ 4.5).
Using the example of a surface plasmon resonance (SPR)-biosensor, this thesis focuses on finding a solution for the problem described. For that purpose, a suitable base coating comprising of linear sodium polyacrylate is established and characterized according to its electrostatic protein adsorption capacity, elutability, layer thickness, measuring field coverage, hydrolytic stability, permeability and swelling characteristics.
Subsequently, the polyanionic immobilization matrix is modified with an asymmetric diamine. Derivatization yields are sufficient to induce a reversal of the negative charge of the sensor coating, turning the net charge to become positive. This allows the so called reversed-charge electrostatic preconcentration, which is characterized by a positive net charge of the immobilization matrix and a negative net charge of the biomolecule to be immobilized. By modifying the initial derivatization method, the reversed-charge electrostatic preconcentration can be combined with a covalent coupling of the acidic biomolecule and a full integration of the coupling process into the automated SPR fluidic system is achieved. Using the example of acidic protein A, the mechanisms of the novel coupling procedure are unveiled and immobilization conditions are identified, which result in high coupling yields and low levels of nonspecific binding of respective sensorchip surfaces.
Besides the efficient covalent coupling of acidic proteins, it is shown for the first time that the novel immobilization method can be used to preconcentrate and couple nucleic acids covalently to carboxylate-based sensor coatings. The potential of SPR-based nucleic acid biosensors using the reversed-charge electrostatic preconcentration is demonstrated by a hybridization experiment to quantify single stranded DNA, which leads to a 8.6-fold increase in sensitivity compared to prior art. Within the scope of a biomolecular interaction analysis with low molecular weight DNA intercalators, the validity and sensitivity of respective DNA-biosensors for the determination of kinetic equilibrium constants is revealed.