Analysis of p97-mediated Ku80 extraction in DNA double-strand break repair in cells

DNA double strand breaks (DSBs) are the most deleterious kind of DNA damage and threaten genomic integrity. Therefore, DSBs need to be repaired to avoid chromosomal aberrations, cell death, and malignant transformation. Sophisticated repair mechanisms have evolved and at least three competing pathways, non-homologous end-joining (NHEJ), homologous recombination repair (HRR), and alternative end-joining can repair DSBs. To ensure successful DSB repair, the complex multistep repair pathways are tightly controlled and the ubiquitin-proteasome system (UPS) has a fundamental role in this regulation. The AAA+-ATPase p97 is a critical factor of the UPS and facilitates extraction and unfolding of ubiquitinated substrate proteins. A set of bifunctional adaptor proteins, which can bind to ubiquitin and to p97, act as cofactors and form a variety of active p97 complexes.
Previous studies have identified that p97 localizes to DSBs and is involved in DSB repair by NHEJ and HRR, which are impaired upon loss of p97. However, the underlying mechanisms and the substrates were unknown. Therefore, we aimed at clarifying the role of p97 and its cofactor proteins in DSB repair. In the present study, p97 was established as factor for Ku80 extraction, which was a promising candidate from a mass spectrometry approach performed in our lab. Ku80 is part of the ring-shaped heterodimer Ku that is essential for NHEJ. Ku rings slide onto open DNA ends and fully encircle the double helix. This special structure and mode of DNA binding prevents dissociation from chromatin and Ku becomes sterically trapped after religation of the DSBs. Hence, extraction of trapped Ku from chromatin requires substantial unfolding by an active mechanism.
In this study, cell-based assays provided strong evidence that p97 extracts Ku80 from chromatin and that this is the major role of p97 in NHEJ. Sophisticated immunofluorescence techniques were established and enabled the visualization and kinetic analysis of DSB-bound Ku80. Additionally, the functionality of p97 cofactors was impaired by RNAi-mediated depletion and CRISPR/Cas9-mediated knockout. The experiments revealed that the p97 cofactors Ufd1-Npl4 and FAF1 participate in p97-mediated Ku80 extraction. For this function, FAF1 was hypostatic to Ufd1 and might contribute to a backup pathway that compensates loss of Ufd1. Moreover, loss of p97 abolished Ku80 extraction and the results indicated that this cannot be compensated. Further, K48-linked polyubiquitin persisted upon loss of p97, but was significantly reduced by Ku80 depletion. This suggests that Ku80 constitutes a major substrate of K48-Ub at DSBs and that p97 targets K48-Ub-modified Ku80 for extraction.
Ku is trapped at the end of NHEJ repair and was described to block end resection, which is an early step in HRR. To analyze whether p97 extracts Ku80 also from open DNA ends to promote HRR, DNA damage was induced with the topoisomerase I (Top1) inhibitor camptothecin (CPT). The transient Top1 cleavage complexes (Top1ccs) are stabilized by CPT and encountering replisomes convert them into single-ended (se) DSBs, which are specifically repaired by HRR. Ku bound to seDSBs and a p97-independent pathway that required MRE11 and CtIP released Ku80 from these lesions. Interestingly, loss of p97 activity reduced the CPT-induced γH2AX level but not the DNA synthesis that was measured simultaneously by incorporation of a nucleotide analogue. Impaired seDSB induction during unperturbed replication suggested that p97-dependent processing sets free CPT-induced seDSBs. Measurement of DNA-bound Top1 and Top1ccs showed that the removal from chromatin was independent of p97, which suggests replisome factors as candidate p97 substrates for future studies.

DNS-Doppelstrangbrüche (DSB) sind die gefährlichste Art der DNS-Schäden und ihre Reparatur ist von zentraler Bedeutung, da die DSB sonst zu Chromosomenabberationen, Zelltod oder maligner Transformation führen können. In den Zellen haben sich spezialisierte Reparaturprozesse entwickelt und DSB können mittels nichthomologer Endverknüpfung (NHEJ), homologer Rekombination (HRR) oder alternativer Endverknüpfung repariert werden. Diese Prozesse sind komplex und müssen genau kontrolliert werden um eine präzise Reparatur zu gewährleisten. Das Ubiquitin-Proteasom-System (UPS) hat eine zentrale Funktion in der Regulation der DSB-Reparatur. Die essentielle AAA+-ATPase p97 ist ein wichtiger Bestandteil des UPS und extrahiert und entfaltet ubiquitinierte Proteine. p97 ist maßgeblich an einer Vielzahl zellulärer Prozesse und interagiert dafür mit bifunktionellen Adapterproteinen, welche an die ATPase und an Ubiquitin binden können. Die Adapter vermitteln die spezifischen Substratbindungen und wirken als Kofaktoren in verschiedenen funktionellen p97-Komplexen.
Vorangegangene Studien haben gezeigt, dass p97 zu Chromatin mit DSB rekrutiert wird und an der DSB-Reparatur über NHEJ und HRR beteiligt ist, da beide Prozesse ohne p97 beeinträchtigt sind. Allerdings waren die zugrundeliegenden Mechanismen und die p97-Substrate unbekannt. Daher war es unser Ziel, die Funktion von p97 und seinen Kofaktoren in der DSB-Reparatur aufzuklären. In der vorliegenden Arbeit wurde beschrieben, dass p97 während der DSB-Reparatur Ku80 extrahiert, welches ein aussichtsreicher Kandidat aus einer massenspektrometrischen Messung unserer Gruppe war. Ku80 ist Bestandteil des ringförmigen Heterodimers Ku, welcher essentiell für die DSB-Reparatur über NHEJ ist. Die beiden Ku-Proteinringe schieben sich auf offene DSB-Enden und umschließen die DNS-Doppelhelix vollständig. Aufgrund der besonderen Struktur und Art der DNA-Bindung wird eine Dissoziation vom Chromatin verhindert und führt dazu, dass Ku nach der DSB-Reparatur sterisch gefangen ist. Folglich erfordert die Ku-Extraktion vom Chromatin ein erhebliches Maß an Proteinentfaltung durch einen aktiven Prozess.
In dieser Arbeit haben zelluläre Experimente starke Evidenzen für eine p97-vermittelte Ku80 Extraktion vom Chromatin ergeben und dafür, dass dies die wichtigste Funktion von p97 in NHEJ ist. Komplexe Immunfluoreszenztechniken wurden etabliert und ermöglichten die Visualisierung und kinetische Analyse von DSB-gebundenem Ku80. Zudem wurde die Funktionalität der p97 Kofaktoren mittels RNA-Interferenz und CRISPR/Cas9-Gen-Knockout beeinträchtigt und die Versuche ergaben, dass Ufd1-Npl4 und FAF1 an der Ku80-Extraktion beteiligt sind. In dieser Funktion war FAF1 hypostatisch zum Ufd1 und ist möglicherweise an einem untergeordneten Prozess beteiligt, welcher den Verlust von Ufd1 kompensieren kann. Der Verlust von p97 hingegen verhinderte die Extraktion von Ku80 vollständig und dies konnte nicht kompensiert werden. Des Weiteren persistierte K48-verküpftes Polyubiquitin nach Hemmung von p97 und dies wurde durch Depletion von Ku80 signifikant reduziert und legt nahe, dass Ku80 ein Hauptsubstrat von K48-verküpftem Ubiquitin an DSB ist und p97 mit K48-Ubiquitin modifiziertes Ku80 extrahiert.
Ku ist am Ende von NHEJ auf dem Chromatin gefangen und wurde zuvor als Blockade für DNS-Endresektion, einem frühen Schritt von HRR, beschrieben. Um zu analysieren ob p97 Ku80 auch von offenen DNS-Enden extrahiert und dadurch HRR fördert, wurden DNS-Schäden mit dem Topoisomerase I Inhibitor Camptothecin (CPT) herbeigeführt. CPT stabilisiert die transienten Topoisomerase I Spaltungskomplexe (Top1cc) die von auftreffenden Replisomen zu einzelendigen DSB (seDSB) umgesetzt werden und folgend nur von HRR repariert werden. Ku80 band an die seDSB und wurde von einem p97-unabhängigen Prozess entfernt, welcher MRE11 und CtIP benötigte. Interessanterweise reduzierte der Verlust der p97-Aktivität die CPT-vermittelte Histon H2AX Phosphorylierung ohne dabei die Replikation zu beeinträchtigen, welche durch den Einbau eines Nukleotidanalogs parallel gemessen wurde. Eine beeinträchtigte seDSB-Induktion bei normaler Replikation deutet darauf hin, dass ein p97-abhängiger Prozess die seDSB freisetzt. Eine Messung der DNS-gebundenen Topoisomerase I und Top1cc zeigte das ihre Entfernung vom Chromatin p97-unabhängig ist. Dies legt die Untersuchung von Replisomproteinen als potentielle p97-Substrate in zukünftigen Studien nahe.

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