Ubiquitin-independent disassembly of the SDS22-PP1-Inhibitor-3 complex in PP1 biogenesis by the AAA-ATPase p97 and SEP domain adapters

Protein phosphatase-1 (PP1) is responsible for a large fraction of all phosphoserine/-threonine dephosphorylation reactions in eukaryotic cells and is as a major regulator of diverse physiological processes. It acts in conjunction with a multitude of binding partners, which serve as targeting or substrate-specifying subunits in PP1 holoenzymes. The catalytic subunit of PP1 alone has low substrate specificity and its activity needs to be restrained before specific holoenzymes are assembled. However, the processes preceding PP1 holoenzyme formation are largely unknown.
Sds22 and Ypi1 are essential interactors of PP1 in Saccharomyces cerevisiae and homologous proteins are present throughout eukaryotes. Both yeast and mammalian SDS22 are required for the antagonistic function of PP1 towards the Aurora B kinase during chromosome segregation in mitosis. Ypi1 is also required for this function in yeast but the role of the mammalian homolog Inhibitor-3 (I3) in mitosis was unknown until we found in an earlier study that it limits the amounts of SDS22 bound to PP1 at the kinetochore. In apparent contradiction to earlier studies, we found that SDS22-bound PP1 is inhibited in its mitotic function. Yeast Sds22 and Ypi1/I3 were recently shown to be required for the stability of the PP1-homolog Glc7. Together, these data indicated that SDS22 and I3 do not merely act as PP1 substrate-specifiers in mitosis.
Sds22, Glc7/PP1 and Ypi1/I3 form a stable trimeric complex in budding yeast and a similar complex is formed in mammalian cells by the counterparts SDS22, PP1 and I3 (SPI complex). Biochemical studies had shown that the catalytic subunit in this complex is inactive. This led us to assume that the SPI complex could serve as an intermediate in PP1 biogenesis. Indeed, the experiments presented here reveal that newly synthesized PP1 interacts transiently with SDS22 and I3 before it binds substrate-specifiers such as NIPP1 or MYPT1. We further show that PP1 remains inactive as long as SDS22 and I3 are bound. Thus, the SPI complex also serves to restrain the unspecific phosphatase activity of the newly synthesized catalytic subunit of PP1.
Release of PP1 from the SPI complex does not occur spontaneously but requires the activity of the AAA-ATPase p97. A link between p97 and PP1 was evident from studies on Shp1, an adapter of the yeast p97-homolog Cdc48. Shp1 was recently shown to be required for the stability of newly synthesized Glc7. As a Cdc48 adapter, it mediates the physical interaction between this ATPase and Glc7, Sds22 and Ypi1. Consistently, we find that p97 is recruited by three Shp1-homologous adapters, p47, p37 and UBXN2A to the SPI complex in human cells. However, while Cdc48 and Shp1 in yeast were proposed to allow Glc7 to bind Sds22 and Ypi1, our data clearly indicate that p97 disassembles the SPI complex.
Furthermore, inhibition of p97 activity or depletion of its adapters inhibited the de novo formation of NIPP1- and MYPT1-PP1 holoenzymes. In a mass spectrometry-based survey of the PP1 interactome, we find that several interactions of PP1 are affected in conditions that inhibit or delay SPI complex disassembly. Of note, this also leads to defects in the mitotic function of PP1. Our results thus reveal a process in PP1 biogenesis, which is required for normal function and holoenzyme formation of this major phosphatase.
Although p97 is known to be recruited by ubiquitination in a plethora of processes, disassembly of the SPI complex proceeded normally despite inhibition of E1 ubiquitin-activating enzymes in cells. To better understand the mechanistic details of the process, we reconsituted SPI complex disassembly by p97 in vitro. We found that in vitro-translated PP1 can form an SPI complex in rabbit reticulocyte lysates and this complex can be disassembled by supplementation of the lysate with p37. In this setting, we identified the SEP domain in p37 as an essential element for this activity of p97.
Further experiments with purified components were performed by Jonas Seiler and Johannes van den Boom and will be published along with the data presented in this thesis. These experiments revealed direct interaction of the p37 SEP domain with I3, indicating that I3 is the direct target of p97 in the SPI complex. This interaction and disassembly of the SPI complex in vitro occurred in the absence of ubiquitination. SPI complex disassembly thus constitutes the first ubiquitin-independent process, in which p97 activity could be demonstrated with a defined substrate.
A range of biochemical approaches established by J. Seiler, J. v. d. Boom and Matthias Kracht showed that p97 unfolds I3 by threading it through the central pore of the hexamer. This uncovers a binding site on PP1, which is required for formation of holoenzymes with the majority of its interactors. The release of I3 allowed subsequent binding of the substrate-specifier NIPP1 and thus, SPI complex disassembly in vitro fully recapitulated the process observed in cells. Importantly, the SPI complex was efficiently disassembled in vitro with sub-stoichiometric concentrations of p97, opening an avenue for future studies of the enzymatic properties of this ubiquitous and pleiotropic ATPase.

Protein phosphatase-1 (PP1) katalysiert einen Großteil der Dephosphorylierungsreaktionen an Phosphoserin/-threonin Aminosäureresten in eukaryontischen Zellen und reguliert so eine Vielzahl physiologischer Vorgänge. PP1 kooperiert mit vielen Bindungspartnern, die als Lokalisation- und Spezifität-bestimmende Untereinheiten in PP1-Holoenzymen dienen. Die katalytische Untereinheit alleine hat nur geringe Substratspezifität und ihre Aktivität außerhalb von Holoenzymen muss beschränkt werden. Wie diese Anforderung in der Biogenese von PP1 erfüllt wird, ist noch unbekannt.
Sds22 und Ypi1 sind essentielle Bindungspartner von PP1 in Saccharomyces cerevisiae und Homologe sind in allen Eukaryonten vorhanden. Sowohl in Hefe als auch in Säugetierzellen ist SDS22 für den Antagonismus zwischen PP1 und der Kinase Aurora B erforderlich, welcher die Chromosomenteilung während der Mitose steuert. Das Hefeprotein Ypi1 ist für diese Funktion von PP1 ebenfalls notwendig. In Säugetierzellen war keine Funktion des homologen Inhibitor-3 (I3) in der Mitose bekannt, bis wir in einer früheren Untersuchung zeigen konnten, dass es die Bindung von SDS22 an Kinetochor-gebundendem PP1 begrenzt. In scheinbarem Widerspruch zu vorherigen Ergebnissen fanden wir, dass PP1 in seiner mitotischen Funktion durch SDS22-Bindung inhibiert wird. In Hefezellen wurde vor Kurzem gezeigt, dass Sds22 und Ypi1/I3 für die Stabilität von Glc7/PP1 benötigt werden. Zusammen genommen sprechen diese Daten dagegen, dass die Hauptfunktion von SDS22 und I3 in der Bestimmung der Substratspezifität von PP1 in der Mitose liegt.
In S. cerevisiae bilden Sds22, Glc7 und Ypi1 einen stabilen trimeren Komplex und ein ähnlicher Komplex zwischen den Homologen SDS22, PP1 und I3 (SPI Komplex) existiert in Säugerzellen. Biochemische Untersuchungen haben gezeigt, dass die katalytische Untereinheit in diesem Komplex inaktiv ist. Das führte uns zu der Annahme, dass der SPI Komplex ein Übergangsstadium in der Biogenese von PP1 darstellen könnte. Tatsächlich zeigen Experimente in dieser Arbeit, dass die neusynthetisierte katalytische PP1-Untereinheit transient mit SDS22 und I3 interagiert, bevor sie Holoenzyme mit NIPP1 oder MYPT1 bildet. Wir zeigen weiterhin, dass PP1 inaktiv bleibt, solange SDS22 und I3 gebunden sind. Der SPI Komplex dient also auch dazu, die unspezifische Aktivität des neusynthetisierten PP1 zu beschränken.
Die Freisetzung von PP1 aus dem SPI Komplex erfolgt jedoch nicht spontan, sondern unter Beteiligung der AAA-ATPase p97. Eine Verbindung zwischen p97 und PP1 wurde in Studien an Shp1, einem Adapter der homologen ATPase Cdc48 in Hefe, gefunden. Vor kurzem konnte gezeigt werden, dass Shp1 benötigt wird um neusynthetisiertes PP1 zu stabilisieren. Als Cdc48-Adapter vermittelt es die direkte Bindung zwischen der ATPase und Glc7, Sds22 und Ypi1. Wir zeigen hier, dass p97 in menschlichen Zellen durch die drei Shp1-homologen Adapter p47, p37 und UBXN2A zum SPI Komplex rekrutiert wird. Während vorgeschlagen wurde, dass Cdc48 und Shp1 die Bindung von Glc7 an Sds22 und Ypi1 ermöglichen, zeigen unsere Daten klar, dass p97 den SPI Komplex löst.
Inhibition der p97 Aktivität oder Depletion der Adapter führte außerdem zu einer geringeren Neubildung der Holoenzyme NIPP1- und MYPT1-PP1. In einer massenspektometrischen Untersuchung des PP1-Interaktoms finden wir veränderte Abundanzen mehrerer Bindungspartner in Bedingungen, die die Lösung des SPI Komplexes behindern. Wir beobachten außerdem, dass die mitotische Funktion von PP1 in diesen Bedingungen gestört ist. Unsere Ergebnisse beschreiben somit einen Vorgang in der Biogenese von PP1, der die normale Funktion und die Bildung von Holoenzymen dieser Phosphatase sicher stellt.
Obwohl bekannt ist, dass p97 in einer Reihe von Funktionen durch die Ubiquitinierung von Substraten gesteuert ist, wird die Lösung des SPI Komplexes in Zellen durch Inhibition der Ubiquitin-aktivierenden E1-Enzyme nicht beeinträchtigt. Um den Mechanismus besser zu verstehen, haben wir den SPI Komplex und seine Lösung durch p97 in vitro rekonstituiert. In vitro-translatiertes PP1 bildet in Retikulozytenlysat einen SPI Komplex und dieser kann durch Zugabe von p37 zum Lysat zur Lösung gebracht werden. Durch solche Experimente können wir zeigen, dass die SEP Domäne in p37 für die Funktion von p97 in diesem Prozess notwendig ist.
Weitere Experimente mit gereinigten Proteinen, durchgeführt von Jonas Seiler und Johannes van den Boom, werden zusammen mit den Ergebnissen dieser Arbeit veröffentlicht. Sie zeigen eine direkte Interaktion der SEP Domäne in p37 mit I3 und somit, dass I3 das direkte Substrat von p97 im SPI Komplex darstellt. Diese Interaktion sowie die Lösung des Komplexes in vitro sind ohne Ubiquitin möglich. Somit ist die Lösung des SPI Komplexes der erste Ubiquitin-unabhängige Prozess, in dem die Funktion von p97 an einem definierten Substrat gezeigt wurde.
Mittels biochemischer Methoden, die von J. Seiler, J. v. d. Boom und Matthias Kracht etabliert wurden, zeigen wir, dass I3 von p97 durch die zentrale Pore gezogen und dabei entfaltet wird. Dadurch wird eine Bindungsstelle an PP1 frei gelegt, die zur Bildung von Holoenzymen mit der Mehrzahl der PP1-Bindungspartner benötigt wird. Die Freisetzung von I3 ermöglichte gleichzeitig die Bindung von NIPP1 und somit wird der in Zellen beobachtete Prozess durch die in vitro Rekonsitution vollständig nachvollzogen. Die Lösung des SPI Komplexes in vitro erfolgte effizient bei sub-stöchiometrischen Konzentrationen von p97 und könnte so in Zukunft enzymkinetische Studien dieser ubiquitär exprimierten, pleiotropen ATPase ermöglichen.

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