Targeting the H3K4 demethylase KDM5B/JARID1B affects the metabolic landscape and malignant phenotype of melanoma cells

Vogel, Felix Christian Eduard GND

Melanoma is one of the most heterogeneous tumors among all cancers. Despite the development of novel therapeutic approaches including targeted and immune checkpoint therapy, most of the patients with advanced melanoma develop resistance and tumor progression after a few months. Over recent years, next to purely genetically driven cancer models, phenotypic heterogeneity models arose suggesting that there is a dynamic switch between different phenotypes allowing cells to functionally escape from therapy. In previous work of our group, a small subpopulation of multi-drug-resistant tumorrepopulating melanoma cells has been identified that was characterized by high expression of the histone H3K4 demethylase KDM5B (also known as JARID1B) and high dependence on oxidative phosphorylation (OXPHOS) leading to a higher production of ATP irrespective of the cells genetic background. In my thesis, I showed that the expression of KDM5B correlates with the expression of various metabolic gene signatures. In detail, the analysis of human melanoma transcriptomes published in The Cancer Genome Atlas (TCGA; from whole melanoma tumors) and of melanoma single cell RNA sequencing results of the Tirosh data set showed that 154 genes significantly overlapped with the expression of KDM5B. 29 of the identified genes (18.9%) encoded for central metabolic proteins. Functionally, 7 out of the 29 metabolic genes were associated with mitochondrial processes and energy metabolism, or are involved in the control of the intracellular redox capacity. The results of my liquid-chromatography-high-resolution-mass-spectrometry (LCHRMS) profiling unraveled the metabolome of the multi-drug resistant KDM5B-driven melanoma cell phenotype. I set up a novel and fast protocol for standardized, high sensitive LC-HRMS of melanoma cells based on functional modulation of the KDM5B expression phenotype by shRNA or doxycycline-induced overexpression. Within the KDM5B-dependent metabolome, I discovered a significant and highly specific regulation of 11 intracellular metabolites and 9 secreted metabolites in the supernatant. In detail, the detected metabolites in KDM5Bhigh cells contribute to an enhanced glutathione-dependent redox capacity, reflect a shift from glycolysis towards the pentose phosphate pathway (PPP), and show metabolic signatures that are characterized by upregulation of oxidative (mitochondrial) bioenergetic pathways. Functionally, as confirmed by physiological activity assays (e.g. Seahorse or GSH/GSSG Glo™ Assay), overexpression of KDM5B in melanoma cells led to broadening of their oxidative metabolism from mainly glutamine-dependent to additionally glucose- and fatty acid-utilizing, upregulation of the pentose phosphate pathway as a source of anti-oxidant NADPH, and maintenance of a high GSH/GSSG ratio. Finally, chemical KDM inhibition (GSK-J1, PBIT, or 2,4-PDCA) significantly regulated the expression of metabolic key enzymes (e.g. glutaminase). My results showed that KDM inhibition decreased proliferation of melanoma cells in a 2D cell culture model and significantly reduced colony formation and invasion in 3D models. Most importantly, similar effects were observed when KDM inhibitors were applied to BRAF-inhibitor resistant melanoma cells. Thus, targeting KDM5B could represent a superior way of modulating the metabolome and malignant cell behavior in melanoma. As soon as better bioavailable compounds are on hand, pre-clinical in vivo models must be performed to further assess the full potential of KDM inhibition in the context of melanoma drug-resistance and systemic tumor progression.

Das maligne Melanom ist einer der heterogensten Tumore aller Krebsarten. Trotz Entwicklung neuer Therapieansätze (z.B. zielgerichtete Therapien oder Immun-Checkpoint-Inhibitoren) entwickeln Patienten mit fortgeschrittenem Melanom rasch Resistenzen, die innerhalb von wenigen Monaten zu erneutem Tumorwachstum führen. Ein Grund für die funktionelle Entstehung dieser Resistenzen ist die hohe phänotypische Tumorheterogenität, welche zusätzlich zu auftretenden genetischen Mutationen den dynamischen Wechsel zwischen verschiedenen Zellphänotypen erlaubt. Vorangegangene Arbeiten unserer Gruppe konnten eine kleine Subpopulation von multi-resistenten Melanomzellen identifizieren, die durch eine hohe Expression der Histon H3K4 Demethylase KDM5B (auch bekannt als JARID1B) charakterisiert war. Diese KDM5Babhängige Zellsubpopulation fiel zudem durch eine erhöhte Abhängigkeit von der mitochondrialen oxidativen Phosphorylierung von ATP (OXPHOS) auf; und zwar unabhängig vom jeweiligen Mutationsstatus der Melanomzellen. In meiner Dissertation konnte ich nun zeigen, dass eine Korrelation zwischen der Expression von KDM5B und der Expression metabolischer Gensignaturen vorlag. Genauer gesagt zeigte meine vergleichende Analyse von publizierten humanen Melanomtranskriptomen des TCGA (The Cancer Genome Atlas) mit Einzelzelltranskriptomen des Tirosh-Datensatzes eine signifikant Expressionsüberlappung von 154 Genen mit der Expression von KDM5B. 29 der identifizierten Gene (18,9%) kodierten für metabolische Schlüsselproteine. Zudem waren 7 dieser 29 Gene funktionell an mitochondrialen Prozessen, dem Energiemetabolismus oder der Regeneration von reaktiven Sauerstoffspezies beteiligt. Die Ergebnisse meiner LC-HRMS (liquid-chromatography-high-resolution-massspectrometry) Analyse kartierten das komplette Metabolom des multi-resistenten KDM5Babhängigen Melanomzellphänotyps. Grundlegend hierfür war die Neuetablierung eines optimierten LC-HRMS-Protokolls zur standardisierten Probenpräparation von KDM5Bregulierten Melanomzellen unter Verwendung von stabilen shRNA Knockdown- und Überexpressionskonstrukten. Meine Analyse zeigt eine signifikante und spezifische Regulation von 11 intrazellulären sowie 9 sezernierten Metaboliten in Abhängigkeit der KDM5BExpression. Im Detail wiesen meine Ergebnisse darauf hin, dass Melanomzellen mit hoher Expression von KDM5B (KDM5Bhigh) funktionell betrachtet (z.B. mittels Seahorse und GSH/GSSG Glo™ Assays) einen breiteren und signifikant erhöhten oxidativen mitochondrialen Metabolismus (OXPHOS) besaßen. Dabei erweiterten die KDM5Bhigh Melanomzellen ihre Substratspezifität für die OXPHOS und konnten so neben Glutamin auch signifikant mehr Glukose, sowie Fettsäuren mitochondrial verstoffwechseln. Parallel dazu erhöhten KDM5Bhigh Melanomzellen die Produktion von NADPH durch den Pentosephosphatweg, um zusammen mit Glutathion (GSH), als zentralem Antioxidans, die Detoxifikation von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) zu ermöglichen. Abschließend konnte ich zeigen, dass die funktionelle KDM-Inhibition mittels GSK-J1, PBIT oder 2,4-PDCA signifikant die Expression von zentralen metabolischen Enzymen (z.B. Glutaminase) reguliert. Meine Ergebnisse wiesen darüber hinaus darauf hin, dass eine Behandlung mit KDM-Inhibitoren die Proliferationsrate sowie die Koloniebildung und das Invasionsverhalten von Melanomzellen signifikant reduziert. Insbesondere entscheidend hierbei war, dass dieser Effekt ebenso bei der Behandlung von BRAF-Inhibitor-resistenten Melanomzellen beobachtet werden konnte. Somit könnte die Inhibition von KDM5B als ein neuer, übergeordneter Therapieansatz angesehen werden, um zukünftig das Metabolom und maligne Verhalten von Melanomzellen zu modulieren. Sobald verbesserte KDM-Inhibitoren mit optimierter Bioverfügbarkeit verfügbar sind, sollte das volle Potential dieser neuen Therapiemöglichkeit auch in präklinischen in vivo Experimenten im Kontext der Therapieresistenz und systemischen Tumorprogression von Melanomen untersucht werden.

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Vogel, Felix Christian Eduard: Targeting the H3K4 demethylase KDM5B/JARID1B affects the metabolic landscape and malignant phenotype of melanoma cells. 2019.

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