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Polymere Mikrogelpartikel als Modellkolloide für Mykoplasmen und deren Abtrennung mit Filtrationsmembranen

Büning, Dominic

Biologische Kontaminationen durch Bakterien und Viren gehören zu den zentralen Herausforderungen in der biopharmazeutischen Industrie. Besonders die Abtrennung von pleomorphen, deformierbaren und gesundheitsschädlichen Mykoplasmen stellt in diesem Zusammenhang kein triviales Trennproblem dar. So konnte gezeigt werden, dass einige Mykoplasmen unter bestimmten Filtrationsbedingungen sogar derzeitig kommerziell verwendete 0,1 μm klassifizierte Sterilfiltermembranen penetrieren können. Daher besteht ein hoher Bedarf speziell für dieses Trennproblem optimierte Hochleistungsmembranen zu entwickeln. Ein wesentliches Problem besteht in diesem Zusammenhang darin, dass die Verwendung von lebenden Mykoplasmen in Filtrationsstudien aufgrund der hierfür benötigten aufwendigen Kultivierung und Handhabung als kosten- und zeitintensiv zu bewerten ist, wodurch die Entwicklung solcher Membranen signifikant erschwert wird. In dieser Arbeit wurde daher die Entwicklung von weichen synthetischen Modellkolloiden angestrebt, welche zu realen Mykoplasmen analoge Eigenschaften aufweisen. Diese Materialien sollen in Filtrationsstudien zur Analyse der wirkenden Trennmechanismen verwendet werden. Zudem wird perspektivisch angestrebt diese synthetischen Partikel als Modellsubstanz im Bereich der Qualitätssicherung der Membranproduktion zu verwenden. In dieser Forschungsarbeit wurden weiche Mikrogele mittels der inversen Miniemulsionspolymerisation von Acrylamid und Acrylat basierten funktionalen Comonomeren und N,N’- Methylenbis(acrylsäureamid) synthetisiert, wobei letzteres als Vernetzer verwendet wurde. Der Einbau von funktionalen Monomeren erlaubte die Einstellung der elektrokinetischen Eigenschaften, die Bildung von spezifischen Bindungsstellen (bspw. primäre Amine) und die direkte oder nachträgliche Markierung dieser Partikel mit Fluoreszenzfarbstoffen. Durch gezielte Variation des Vernetzeranteils konnten die Quellung dieser Materialien in Wasser beeinflusst und deren mechanische Eigenschaften justiert werden. Die Variation des polymeren Feststoffgehalts hatte hingegen einen direkten Einfluss auf die mittlere Größe der erzeugten Miniemulsionströpfchen und beeinflusste zusätzlich ebenfalls die späteren mechanischen Eigenschaften der hieraus synthetisierten Mikrogele. Im Zuge dieser Arbeit wurde eine ganze Bibliothek von Mikrogelen mit verschiedenen Eigenschaften entwickelt, von denen bspw. zwei über eine gleiche Größe (180 nm) und gleichzeitig stark abweichende Deformierbarkeiten verfügten. Es konnte zudem gezeigt werden, dass diese Modellpartikel zu realen Mykoplasmen analoge Oberflächen- und mechanische Eigenschaften aufweisen. Ein wesentliches Problem bei der Verwendung dieser Modellpartikel in realen Filtrationsstudien besteht in der geringen realen Belastung solcher Sterilfiltermembranen in der biopharmazeutischen Industrie, wodurch sehr geringe Konzentrationen quantifiziert werden müssen. Klassische Markierungsoptionen (bspw. Fluoreszenzfarbstoffe) bieten in diesem Zusammenhang keine ausreichende Nachweisbarkeit. Aus diesem Grund wurde in dieser Arbeit eine neuartige Markierung der Mikrogele mit geeigneten DNA-Fragmenten entwickelt, welche anschließend mittels der quantitativen Polymerasekettenreaktion quantifiziert werden konnten. Im letzten Teil dieser Arbeit wurden die erstellten Modellkolloide in dead-end Filtrationsstudien an einem Endfilter einer derzeit kommerziell verwendeten Sterilfiltermembran eingesetzt. Hierbei wurde der Einfluss des applizierten Transmembrandrucks, die Partikelbelastung, die Deformierbarkeit der Partikel und der Einfluss des Rührens auf die Filtration und das Fouling untersucht. Im Verlauf der Filtrationen führte die Ablagerung von Mikrogelen zunächst zur Blockierung von Poren und anschließend zur Bildung eines klassischen Filterkuchens, welcher gegen Ende der Filtration durch die Rückvermischung beeinflusst wurde. Es konnte gezeigt werden, dass die untersuchten Parameter den Verlauf der genannten Phasen beschleunigten oder verlangsamten. Es konnte bspw. gezeigt werden, dass sehr weiche Mikrogele die Membran bei sehr hohen Transmembrandrücken (2 bar) signifikant penetrierten und damit die Bildung eines Filterkuchens an der Oberseite der Membran verzögerten. Obwohl diese Erkenntnisse für alternative Applikationen, wie die Mikrofiltration von hochkonzentrierten Mikrogeldispersionen, eine hohe Relevanz aufweisen, muss konstatiert werden, dass in dieser Studie keine neuen Erkenntnisse hinsichtlich der Abtrennung solcher weichen Kolloide bei zur Sterilfiltration vergleichbaren Konzentrationen gewonnen werden konnten. Jedoch liefert diese Arbeit einen signifikanten Beitrag zur Entwicklung geeigneter Modellpartikel und damit zur Erlangung eines umfassenden Verständnisses der Abtrennung von realen Mykoplasmen mit Sterilfiltermembranen.

Biological contaminants such as bacteria and viruses are among the most important challenges in the current biopharmaceutical industry. In particular, the separation of highly pleomorphic, deformable and infectious bacteria like mycoplasma with current polymeric sterile filtration membranes cannot guarantee full protection under all filtration conditions. It is known that some mycoplasma species can even penetrate state of the art 0.1 μm rated sterile filtration membranes. Consequently, there is a very high demand for high performance membranes, specifically optimized for this separation problem. However, working with living mycoplasma is rather expensive, laborious and time-consuming. Therefore, this work was focusing on the development of soft synthetic model colloids mimicking all critical properties of real mycoplasma. These materials should enable an easy and fast analysis of the filtration process and may ultimately be used as tool for quality assurance in field of membrane production. In this study soft sub-micron sized microgels were synthesized via inverse miniemulsion polymerization of acrylamide, acrylate based functional comonomers and N,N’-methyl- enebiscarylamide, with the latter acting as coss-linker. The incorporation of functional monomers allows tailoring the electrokinetic properties, the formation of specific binding sites (e.g. primary amines) and direct or subsequent labeling with fluorescent dyes. The variation of the cross-linker content allowed to tune the swelling of these materials in water and influenced by that their mechanical properties. The variation of the polymeric solid content allowed to tune the droplet size and influenced additionally the mechanical properties of the later microgels. In the end, a fully characterized set of different microgels was developed, including two microgel types with about the same size (180 nm) but different deformability. It was shown that these model colloids are able to mimic all critical properties of real mycoplasma to a large extent. It turned out that the quantification of synthetic microgels with existing labeling techniques (e.g. fluorescence dyes) is insufficient when it comes to the quantification of ultra low concentrations of contaminants, as it is common for real sterile filter applications. Therefore, a novel labeling method was developed, offering advanced detection limits by using quantitative polymerase chain reaction for the quantification of DNA-labeld microgels. In the last part of this work different modell colloids were used in dead-end filtration studies using the endfilter of a state of the art sterile membrane filter. Here, the influences of the applied transmembrane pressure, the particle challenge, the deformability of the model particles and the effect of the stirring on the microfiltration process and the microgel deposition progression were investigated. During the course of the filtrations the deposition of microgels first lead to pore blocking, followed by the formation of a classical cake layer, which matured in the end of the filtration when the feed was stirred. It was found that these different filtration phases were accelerated or delayed in dependency to the mentioned influencing parameters. For example, super soft microgels penetrated the membrane at high transmembrane pressures (2 bar) to a very high extent, delaying the formation of a self-rejection cake layer. Although these results might be relevant for the microfiltration of highly concentrated microgel dispersions, it must be confessed that there is still a lack of knowledge when it comes to low concentrated feed streams, as it is relevant for sterile filter applications. However, this work is one step further on the way to a comprehensive understanding of separation mechanism of mycoplasma by sterile filter membranes.

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Büning, Dominic: Polymere Mikrogelpartikel als Modellkolloide für Mykoplasmen und deren Abtrennung mit Filtrationsmembranen. 2019.

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